Ст 183 тк рф: ТК РФ Статья 183. Гарантии работнику при временной нетрудоспособности

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 183 ТК РФ.

При временной нетрудоспособности работодатель выплачивает работнику пособие по
временной нетрудоспособности в соответствии с федеральными законами.

Размеры пособий по временной нетрудоспособности и условия их выплаты устанавливаются
федеральными законами.

Комментарий к Ст. 183 Трудового кодекса РФ

1. Обеспечение лиц, подлежащих социальному страхованию, в том числе работающих по трудовому договору, пособиями по временной нетрудоспособности предусмотрено Федеральным законом от 29 декабря 2006 г. N 255-ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством».

2. В отличие от общей нормы, установленной в подп. 4 п. 1 ст. 9 Федерального закона от 16 июля 1999 г. N 165-ФЗ «Об основах обязательного социального страхования», в соответствии с которой отношения по обязательному социальному страхованию у застрахованных возникают с момента заключения трудового договора с работодателем, п. 5 ст. 2 Федерального закона «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством» содержит иное правило: лицо является застрахованным со дня, с которого оно должно было приступить к работе в соответствии с трудовым договором, либо со дня фактического допуска к работе согласно трудовому законодательству. Другими словами, если заключен трудовой договор, которым предусмотрена дата начала работы (см. ст. 61 ТК РФ и комментарий к ней), и работник стал временно нетрудоспособен до наступления этой даты, право на пособие по временной нетрудоспособности возникает у него только с того дня, когда он должен был приступить к работе. При наступлении временной нетрудоспособности во время следования к месту работы пособие выдается по таким же правилам.

3. В ряде случаев пособие выдается и при условии, что временная нетрудоспособность наступила после прекращения трудового договора. Это возможно, если заболевание или травма наступили в течение 30 календарных дней после прекращения трудового договора (п. 2 ст. 5 Федерального закона «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством»). Пособие в этом случае выплачивается работодателем по прежнему месту работы.

Пособие по временной нетрудоспособности после прекращения трудового договора выплачивается только в случае заболевания или травмы самого застрахованного и не выплачивается при других основаниях временной нетрудоспособности (при уходе за заболевшим членом семьи, протезировании, карантине и т.п.).

4. Право на рассматриваемое пособие имеют также совместители. Это предусмотрено ч. 2 ст. 287 ТК РФ, которая закрепляет за совместителями право на гарантии и компенсации, предусмотренные ТК РФ, другими законами и иными нормативными правовыми актами, коллективными договорами, соглашениями, локальными нормативными актами организаций, в полном объеме. Это касается и гарантий, предусмотренных комментируемой статьей. Кроме того, это прямо предусмотрено и п. 1 ст. 13 Федерального закона «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности».

5. Основанием для выдачи пособия по временной нетрудоспособности является листок нетрудоспособности. Порядок выдачи листков нетрудоспособности установлен Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 29 июня 2011 г. N 624н. Выдача листков нетрудоспособности осуществляется лицами, имеющими в соответствии с законодательством РФ о лицензировании лицензию на медицинскую деятельность, включая работы (услуги) по экспертизе временной нетрудоспособности.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

Листок нетрудоспособности выдается гражданину медицинской организацией по его желанию в день обращения либо в день закрытия листка нетрудоспособности. Если лечение осуществляется в амбулаторно-поликлинических условиях, листок нетрудоспособности выдается в день установления временной нетрудоспособности на весь период временной нетрудоспособности, включая нерабочие праздничные и выходные дни. Гражданам, обратившимся за медицинской помощью после окончания рабочего времени (смены), по их желанию дата освобождения от работы в листке нетрудоспособности может быть указана со следующего календарного дня.

Лечащий врач единолично выдает листки нетрудоспособности сроком до 15 календарных дней включительно. При сроках временной нетрудоспособности, превышающих 15 календарных дней, листок нетрудоспособности выдается и продлевается по решению врачебной комиссии, назначаемой руководителем медицинской организации.

В случае если гражданин на момент наступления временной нетрудоспособности занят у нескольких работодателей, а в двух предшествующих календарных годах был занят у других работодателей (другого работодателя), выдается один листок нетрудоспособности для представления по одному из последних мест работы по выбору гражданина; в случае если гражданин на момент наступления временной нетрудоспособности занят у нескольких работодателей, а в двух предшествующих календарных годах был занят как у этих, так и у других работодателей (другого работодателя), выдается либо несколько листков нетрудоспособности для представления по каждому месту, либо один листок нетрудоспособности для представления его по одному из последних мест работы по выбору гражданина.

Форма бланка листка нетрудоспособности утверждена Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 26 апреля 2011 г. N 347н.

6. По общему правилу пособие выдается за весь период временной нетрудоспособности. Исключения из этого правила установлены в следующих случаях:

выдача пособия по временной нетрудоспособности, наступившей в период спора о восстановлении, — со дня вынесения решения о восстановлении на работе;

выдача пособия работникам, заключившим срочный трудовой договор на срок до шести месяцев (за исключением пособия при заболевании туберкулезом), — не более чем на 75 календарных дней по этому договору; при заболевании туберкулезом пособие выплачивается до дня восстановления трудоспособности или установления инвалидности с ограничением способности к трудовой деятельности;

выдача пособия лицу, у которого заболевание или травма наступили со дня заключения трудового договора до дня его аннулирования, — со дня, когда он должен был приступить к работе, не более чем на 75 календарных дней;

выдача пособия работающим инвалидам — до четырех месяцев подряд или до пяти месяцев в календарном году, за исключением пособия при трудовом увечье или профессиональном заболевании, которое выдается на общих основаниях.

7. Пособие по временной нетрудоспособности выдается в случаях заболевания и травмы, связанных с утратой трудоспособности; при долечивании непосредственно после стационарного лечения в санаторно-курортных учреждениях, находящихся на территории РФ; при болезни члена семьи в случае необходимости ухода за ним; при карантине; при протезировании с помещением в стационар протезно-ортопедического предприятия.

8. При наступлении временной нетрудоспособности вследствие заболевания (травмы) во время пребывания в ежегодном (основном или дополнительном) отпуске пособие выдается за все дни освобождения от работы, удостоверенные листком нетрудоспособности.

При наступлении временной нетрудоспособности в период отпуска без сохранения заработной платы либо отпуска по уходу за ребенком пособие не выдается. Если нетрудоспособность продолжается и после окончания отпуска без сохранения заработной платы либо частично оплачиваемого отпуска по уходу за ребенком, то пособие выдается со дня, когда работник должен был приступить к работе.

9. Пособие при санаторно-курортном (амбулаторно-курортном) лечении выдается только в случае, если работник направлен на долечивание в санаторно-курортное учреждение непосредственно из стационара. Пособие выплачивается за весь период пребывания в санаторно-курортном учреждении, но не более чем за 24 календарных дня.

10. Пособие при уходе за больным членом семьи выдается в зависимости от возраста заболевшего.

В случае болезни взрослого (лица старше 15 лет) пособие выдается не более чем на семь календарных дней по каждому случаю заболевания, но не более чем на 30 календарных дней в календарном году по всем случаям ухода за этим членом семьи. По завершении этого срока, если необходимость в постороннем уходе не отпала, выдается справка, на основании которой работодатель обязан освободить ухаживающего от работы (предоставить ему отпуск) без сохранения заработной платы.

В случае болезни ребенка пособие выдается:

при амбулаторном лечении или совместном пребывании в стационарном лечебно-профилактическом учреждении с ребенком в возрасте до 7 лет — на весь период лечения, но не более 60 календарных дней в календарном году по всем случаям ухода за этим ребенком;

при амбулаторном лечении или совместном пребывании в стационарном лечебно-профилактическом учреждении с ребенком в возрасте до 7 лет, чье заболевание включено в перечень заболеваний, утвержденный Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 20 февраля 2008 г. N 84н, — на весь период лечения, но не более 90 календарных дней в календарном году по всем случаям ухода за этим ребенком;

при амбулаторном лечении или совместном пребывании в стационарном лечебно-профилактическом учреждении с ребенком в возрасте от 7 до 15 лет — до 15 календарных дней по каждому случаю заболевания, но не более 45 календарных дней в календарном году по всем случаям ухода за этим ребенком;

при амбулаторном лечении или совместном пребывании в стационарном лечебно-профилактическом учреждении с ребенком-инвалидом в возрасте до 15 лет — на весь период лечения, но не более 120 календарных дней в календарном году по всем случаям ухода за этим ребенком;

при амбулаторном лечении или совместном пребывании в стационарном лечебно-профилактическом учреждении с ребенком в возрасте до 15 лет, являющимся ВИЧ-инфицированным, — на весь период лечения.

В случае болезни детей и подростков в возрасте до 18 лет, проживающих в зоне отселения и зоне проживания с правом на отселение, эвакуированных и переселенных из зон отчуждения, отселения, проживания с правом на отселение, включая тех, которые на день эвакуации находились во внутриутробном состоянии, а также детям первого и последующих поколений граждан, перенесших лучевую болезнь или иные заболевания, связанные с радиационным облучением в результате аварии на Чернобыльской АЭС, ставших инвалидами вследствие этой аварии, принимавших участие в работах по ликвидации последствий аварии в 1986 — 1987 гг., а также эвакуированных из зоны отчуждения или переселенных из зоны отселения, родившимся после радиоактивного облучения вследствие чернобыльской катастрофы одного из родителей, пособие выдается за все время болезни (ст. 25 Закона РФ от 15 мая 1991 г. N 1244-1 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»).

11. При карантине пособие выдается, если работник был отстранен от работы органами санитарно-эпидемиологической службы вследствие инфекционного заболевания лиц, окружавших его, либо в случае выявления его бактерионосительства. Если ребенок, бывший в контакте с заболевшими, не может посещать детскую дошкольную организацию, пособие при карантине выдается ухаживающему за ним лицу. Такое же правило действует при карантине иных членов семьи, признанных в установленном порядке недееспособными. Пособие выплачивается за весь период карантина.

12. При протезировании в стационаре протезно-ортопедического учреждения пособие выдается за все время нахождения в стационаре и за время проезда в стационар и обратно.

13. Размер пособия по временной нетрудоспособности определяется в процентном отношении к заработку работника.

Пособие в размере 100% выплачивается:

при трудовом увечье или профессиональном заболевании, а также при обострении прежнего трудового увечья и профессионального заболевания;

работникам, имеющим страховой стаж восемь лет и более.

Пособие в размере 80% выплачивается работникам, имеющим страховой стаж от пяти до восьми лет.

Остальным работникам пособие выплачивается в размере 60% заработка.

Страховой стаж исчисляется ко дню наступления нетрудоспособности. Порядок его исчисления установлен Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 6 февраля 2007 г. N 91.

14. Специальные правила установлены для исчисления размера пособия по уходу за заболевшим ребенком. При амбулаторном лечении ребенка за первые 10 календарных дней пособие выплачивается в размере, определяемом в зависимости от страхового стажа ухаживающего за ним лица, а далее — в размере 50% среднего заработка. При стационарном лечении ребенка пособие за весь период выплачивается в размере, определяемом с учетом страхового стажа ухаживающего за ним лица. При болезни ребенка, связанной с поствакциональными осложнениями, а также ребенка, пострадавшего от последствий чернобыльской катастрофы, пособие выдается в размере 100% заработка за все время болезни. При уходе за ребенком, страдающим заболеванием, полученным вследствие радиационного воздействия на его родителей, пособие за весь период ухода выплачивается в размере 100% заработка.

15. Пособия исчисляются исходя из среднего заработка работника, рассчитанного за два календарных года, предшествующих году наступления временной нетрудоспособности, в том числе за время работы у другого работодателя (других работодателей). Средний заработок за время работы у другого работодателя (других работодателей) не учитывается в случаях, если пособие назначается и выплачивается работнику по всем местам работы исходя из среднего заработка за время работы у каждого работодателя. Это может иметь место в том случае, если работник в течение всех двух предшествующих лет был занят у одних и тех же работодателей.

В случае если в двух календарных годах, непосредственно предшествующих году наступления временной нетрудоспособности, либо в одном из указанных годов работник находился в отпуске по беременности и родам и (или) в отпуске по уходу за ребенком, соответствующие календарные годы (календарный год) по заявлению работника могут быть заменены в целях расчета среднего заработка предшествующими календарными годами (календарным годом) при условии, что это приведет к увеличению размера пособия.

16. Минимальный размер пособия не установлен.

Максимальный размер пособия определяется исходя из предельной величины заработной платы, на которую начисляются взносы на обязательное социальное страхование. Эта сумма определяется в п. 4 ст. 8 Федерального закона от 24 июля 2009 г. N 212-ФЗ «О страховых взносах в Пенсионный фонд Российской Федерации, Фонд социального страхования Российской Федерации, Федеральный фонд обязательного медицинского страхования» и ежегодно индексируется Правительством РФ.

17. Особый порядок определения размера пособия установлен для лиц, имеющих страховой стаж менее шести месяцев. Пособие им выплачивается в размере, не превышающем за полный календарный месяц минимальный размер оплаты труда, установленного федеральным законом, а в районах и местностях, в которых в установленном порядке применяются районные коэффициенты к заработной плате, — минимальный размер оплаты труда с учетом этих коэффициентов.

18. Федеральным законом «Об обеспечении пособиями по временной нетрудоспособности, по беременности и родам граждан, подлежащих обязательному социальному страхованию» в п. 2 ст. 3 предусмотрено, что пособие по временной нетрудоспособности при заболевании и травме (за исключением пособий по временной нетрудоспособности при несчастном случае на производстве и профессиональном заболевании) за первые три дня нетрудоспособности выплачивается за счет средств работодателя, а за остальной период начиная с четвертого дня — за счет средств Фонда социального страхования РФ.

Такой порядок выплаты пособия распространяется и на те случаи, когда нетрудоспособность наступила вне места нахождения организации (во время командировки, в период отпуска и т.п.).

19. Пособие выплачивается:

работодателем по каждому месту работы;

работодателем по одному из последних мест работы по выбору работника, если в течение двух предшествующих лет он был занят у других работодателей;

работодателем по последнему месту работы, если нетрудоспособность наступила в течение 30 дней после прекращения трудового договора;

территориальными органами Фонда социального страхования РФ, если к моменту обращения за пособием деятельность работодателя прекращена либо если в связи с недостаточностью денежных средств на счетах в кредитных организациях он не имеет возможности выплатить пособие.

Пособие выплачивается при условии, что обращение за ним последовало не позднее шести месяцев со дня восстановления трудоспособности или установления инвалидности. Срок, пропущенный по уважительным причинам, может быть восстановлен по решению территориального органа Фонда социального страхования РФ.

Перечень уважительных причин определен Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 31 января 2007 г. N 74. Он включает такие причины, как наступление чрезвычайных, непредотвратимых обстоятельств (например, стихийные бедствия), длительная болезнь или травма (более шести месяцев), переезд в другую местность, вынужденный прогул при незаконном увольнении или отстранении от работы, повреждение здоровья или смерть близкого родственника, иные причины, признанные уважительными судом.

Пособие выплачивается в сроки, установленные для выплаты заработной платы. При длительном заболевании к оплате может быть предъявлен и незакрытый листок временной нетрудоспособности.

20. Пособие по временной нетрудоспособности не выдается:

за время отстранения от работы (см. ст. 76 ТК РФ и комментарий к ней), если за этот период не начисляется заработная плата;

за время освобождения от работы с полным или частичным сохранением заработной платы или без оплаты;

при наступлении временной нетрудоспособности, квалифицированной судом как результат умышленного причинения вреда своему здоровью или попытки самоубийства;

при наступлении временной нетрудоспособности вследствие совершения умышленного преступления;

за время заключения под стражу или административного ареста;

за время прохождения судебно-медицинской экспертизы.

Работникам, нарушающим режим, предписанный врачом, либо не являющимся без уважительных причин на прием к врачу или на проведение медико-социальной экспертизы, пособие выплачивается в размере, не превышающем минимальный размер оплаты труда за полный календарный месяц, со дня указанных нарушений. Работникам, заболевание или травма которых наступили вследствие алкогольного, наркотического, токсического опьянения или действий, связанных с опьянением, пособие в размере, не превышающем минимальный размер оплаты труда за полный месяц, выплачивается за весь период нетрудоспособности.

Статья 183 ТК РФ. Гарантии работнику при временной нетрудоспособности. Комментарии

Статья 183 ТК описывает, какие гарантии положены сотруднику при его временной нетрудоспособности. Она имеет небольшой объём и ссылочный характер.

Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ

Содержание ст. 183 ТК

Рассматриваемая статья включает два абзаца. В первом из них указано, что в ситуации временной нетрудоспособности сотрудника на нанимателе лежит обязанность выплаты ему специального пособия по временной нетрудоспособности в соответствии с федеральным законодательством.

Во втором абзаце подчёркивается, что такие параметры этого пособия, как объём и условия выплат, устанавливаются соответствующими федеральными законами.

Рассмотренная статья, как видно из её содержания, ссылается на положения других законодательных актов федерального уровня, а не устанавливает фиксированные параметры выплат сотруднику при его временной нетрудоспособности.

Основные вопросы по использованию положений ст. 183 ТК

Какие федеральные законы, на которые ссылается данная статья, регулируют выплату пособия по временной нетрудоспособности?

Этому вопросу специально отведена глава 2 ФЗ № 255 от 29.12.06, посвящённого обязательному страхованию персонала. В этой главе прописаны:

• ситуации, когда необходимо выплачивать данное пособие;
• его условия и сроки выплат;
• размеры пособия;
• аспекты, влияющие на возможность снижения выплат, а также на их полную отмену;
• периоды, когда данное пособие не выплачивается, и т.д.

Общие основы соцстрахования разобраны в ФЗ № 165 от 16.07.99. В нём описаны аспекты уплаты надлежащих страховых взносов, права и обязанности основных субъектов и иные подобные моменты.

Необходимо отметить, что эти ФЗ, как и соответствующие статьи ТК, базируются на решениях МОК. Конвенциями МОК № 24, 25, 130 и другими постановлениями предусмотрены разнообразные основы для страхования трудящихся. Также ст. 39 Конституции указывает на гарантии соцобеспечения для граждан РФ, в том числе в случае их болезни.

Описание нюансов выплаты пособия по временной нетрудоспособности в специализированных ФЗ объясняется тем, что сотрудник подлежит страхованию, предусматривающему, в том числе, и подобные выплаты, с момента официального оформления его поступления на работу, что ясно указано в статьях 21 и 22 ТК. Также нужно отметить, что сотрудник сохраняет право на получение данного пособия в течение 30 дней после окончания трудовых взаимоотношений.

В какой форме признаётся временная нетрудоспособность сотрудника?

Необходимо отметить, что предпосылкой для этого признания является не сам факт наступления подобной нетрудоспособности, а оформленное в официальной форме освобождение от работы. Порядок данного освобождения закреплён в Приказе Минздрава № 925н от 01.09.20. В нём прописаны аспекты оформления листка, удостоверяющего нетрудоспособность, порядок его выдачи для разных групп персонала и иные подобные моменты. Также нужно отметить, что в этом приказе предусмотрена возможность оформить соответствующий документ в электронном формате. Сопутствующая информация доступна в личном кабинете на портале Госуслуг.

Аспекты взаимодействия между различными субъектами, задействованными в оформлении данного пособия, подробно разобраны в Постановлении Правительства № 1567 от 16.12.17.

В каких ситуациях возможно снижение пособия по нетрудоспособности или даже его отмена?

Эти варианты предусмотрены в статьях 8 и 9 вышеупомянутого ФЗ № 255 от 29.12.06. Так, размер положенных выплат может быть уменьшен, если сотрудник:

• нарушил предписанный для него врачебный режим;
• отсутствовал по неуважительной причине на медэкспертизе или осмотре;
• заболел/травмировался из-за наркотиков, опьянения и т.д.

Пособие может быть вовсе отменено, если сотрудник:

• умышленно нанёс вред своему здоровью, в т.ч. путём замысла самоубийства;
• причинил себе вред в ходе совершения преступных действий.

Также отдельно предусмотрены и ситуации, когда пособие отменяется на определённый срок. Это может произойти, к примеру, когда сотрудник проходит медэкспертизу, находится под административным арестом и в иных подобных ситуациях.

Какие факторы определяют величину пособия по временной нетрудоспособности?

Эти факторы детально разобраны в статье 7 вышеуказанного ФЗ № 255.

В первую очередь принимается во внимание страховой стаж сотрудника. Не менее важен и размер его официальных заработков. Чем больше зарплата сотрудника и значительнее его трудовой стаж – тем выше и размер положенных ему денежных выплат. Так, сотруднику со стажем 8 лет в форме данного пособия выплачивается 100% его заработка, а если стаж менее 5 лет – только 60%. Также дополнительно необходимо принимать во внимание действующие в данной местности районные коэффициенты и надбавки, влияющие на величину зарплат.

Статья 183 ТК РФ с комментариями

Полный текст ст. 183 ТК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 183 ТК РФ.

При временной нетрудоспособности работодатель выплачивает работнику пособие по временной нетрудоспособности в соответствии с федеральными законами .

Размеры пособий по временной нетрудоспособности и условия их выплаты устанавливаются федеральными законами .

Комментарий к статье 183 ТК РФ

В комментируемой статье в качестве гарантий указаны выплаты, которые производятся работнику при временной нетрудоспособности (пособие по временной нетрудоспособности). Указанные выплаты по своей сути не являются гарантийными, и отношения, возникающие в связи с их предоставлением и получением, относятся к отрасли права социального обеспечения.

Основным законом, регулирующим порядок и размер выплаты больничного, является ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством».

Согласно п.5 ст. 13 данного закона для назначения и выплаты больничного работник обязан представить работодателю:
— справки о сумме заработка, из которого должно быть исчислено пособие, с предыдущих мест работы;
— листок нетрудоспособности, выданный медицинской организацией.

Листки нетрудоспособности вправе выдавать организации с лицензией на медицинскую деятельность, в том числе на выполнение работ (услуг) по экспертизе временной нетрудоспособности (п.2 Порядка выдачи листков нетрудоспособности, утвержденного приказом Минздравсоцразвития РФ от 29 июня 2011 года N 624н).

Листок нетрудоспособности выдается лицам, застрахованным в системе обязательного медицинского страхования на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством (п.1 Порядка выдачи листков нетрудоспособности, ч.1 ст. 2 ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством»).

Справка о сумме заработка выдается предыдущими работодателями по форме, утвержденной приложением N 1 к приказу Минздравсоцразвития России от 17 января 2011 года N 4н. Согласно ст. 14 ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством» размер больничного исчисляется исходя из среднего заработка работника за два календарных года, предшествующих году обращения за больничным. При этом работник обязан представить сведения о доходах, полученных за этот период не только на нынешнем месте работы, но и у всех предыдущих работодателей.

Консультации и комментарии юристов по ст 183 ТК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 183 ТК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

ст 183 ТК РФ. Гарантии работнику при временной нетрудоспособности

Главная — ГЛАВА 28. ДРУГИЕ ГАРАНТИИ И КОМПЕНСАЦИИ — ст 183 ТК РФ. Гарантии работнику при временной нетрудоспособности Задать вопрос юристу
При временной нетрудоспособности работодатель выплачивает работнику пособие по временной нетрудоспособности в соответствии с федеральными законами. Размеры пособий по временной нетрудоспособности и условия их выплаты устанавливаются федеральными законами.

trkodeks.ru/stat/tk-glava-28/statia-183/

26.10.2015 — Геннадий Благонравов

оплата болничного листа уволившемуся работнику в течение месяца с момента уволнения.

Ответ на вопрос дан по телефону.

---

02.06.2015 — Денис Кирюнчев

Работник находиться на больничном. Но сегодня вышел на работу в связи с проверкой в праве ли мы составить акт о нарушении больничного листа.

---

04.04.2015 — Леонид Гольдин

оплата больничного листа уволившемуся работнику в течение месяца с момента увольнения

Ответ на вопрос дан по телефону.

---

27.07.2011 — Екатерина

Здравствуйте!
Я нахожусь в отпуске по уходу за ребенком до 3х лет, одновременно с этим я беременна и мне получается нужен больничный для перехода из отпуска по уходу за ребенком в декретный больничный. Но женская консультация отказывается выдавать б/л мотивируя тем, что я в отпуске. Какая статья закона регулирует это? Помогите, пожалуйста!

Ответ на вопрос дан по телефону.

---

30.06.2011 — Евгений

Если больничный лист не закрыт, а продолается мне должны начислить зарплату за месяц который уже прошел?

---

22.02.2011 — Вадим Романович

Здравствуйте!У меня к Вам такой вопрос:В данной организаций я работаю с мая 2010 года по настоящий день.22 декабря 2010 года я поломал лодыжку на ноге после рабочего дня в городе.Вышел на больничный как положено 19 января предоставил больничный лист при этом продолжая быть на больничном дальше.Стаж работы по трудовой книжке 8.5 лет.В данной организаций работаю с мая месяца.При этом узнаю что мне заплатили больничный по минимальной копейки .для этого аргументом стало что у вас нет справки по заработной плате с прошлой место работы . После того как я предоставлю справку им с последнего места работы по заработной плате.Они обязаны сделать перерасчёт мне за больничный январь месяц .

Ответ на вопрос дан по телефону.

---

16.11.2010 — Ольга

Здравствуйте.У меня такой вопрос:Я беременна,всегда работала по договору, с 1 сентября 2010 г. устроилась по ТК на почтовое отделение.Дикретный отпуск мне назначили с 22 ноября 2010 г.Оклад мой составляет 14 т.р. Скажите пожалуйста, будет ли мне оплачен дикретный отпуск и каковы будут выплаты? Заранее спасибо!

Ответ на вопрос дан по телефону.

---

Что полагается работнику в случае болезни в отпуске? | Компания права Респект — КонсультантПлюс Уфа

Если вы заболели во время ежегодного оплачиваемого отпуска (основного или дополнительного), то отпуск должен быть продлен или перенесен на другой срок.

Вместе с тем, если вы взяли больничный в связи с уходом за заболевшим членом семьи, то на период предоставленного отпуска это не повлияет (ч. 1 ст. 124 ТК РФ; Определение Верховного Суда РФ от 28.02.2013 N АПЛ13-18).

При болезни в отпуске с последующим увольнением, а также в других отпусках (учебный отпуск, отпуск без сохранения зарплаты и пр.) работодатель не обязан продлевать или переносить отпуск. Исключением является отпуск по беременности и родам, который может быть продлен в случае осложненных родов по дополнительному листку нетрудоспособности (п. п. 22, 40, 48 Порядка, утв. Приказом Минздравсоцразвития России от 29.06.2011 N 624н).

Продление ежегодного оплачиваемого отпуска

По умолчанию ежегодный отпуск продляется автоматически на все дни болезни, которые пришлись на период этого отпуска. Основанием для продления является листок нетрудоспособности, который в случае болезни в период ежегодного отпуска выдается в общем порядке (п. 24 Порядка).

Для подтверждения уважительности своего отсутствия вы должны предоставить работодателю листок нетрудоспособности по выходе на работу. При этом необходимо заранее предупредить работодателя о своей болезни любым доступным способом, например позвонив по телефону.

При продлении отпуска число его дней не меняется, поэтому работодатель не должен пересчитывать выплаченные вам отпускные.

Кроме того, период ежегодного отпуска не продлевается на дни болезни, которые совпали с нерабочими праздничными днями, поскольку праздничные дни отпуском не являются (ч. 1 ст. 120 ТК РФ).

Перенос ежегодного оплачиваемого отпуска

Вы можете выйти на работу после окончания ежегодного отпуска и подать заявление о переносе его дней, которые не были использованы из-за вашей болезни. В заявлении нужно указать причину переноса отпуска (болезнь), а также даты, на которые вы желаете перенести оставшуюся часть отпуска. К заявлению необходимо приложить листок нетрудоспособности. Тогда отпуск может быть перенесен на другой срок.

Вместе с тем перенос отпуска на другой срок, указанный вами, является правом, а не обязанностью работодателя. При переносе отпуска на другой срок работодатель должен повторно рассчитать отпускные за перенесенные дни отпуска. Уже выплаченные отпускные могут быть зачтены в счет выплат, причитающихся вам в будущем. По общему правилу удерживать из зарплаты отпускные за неиспользованные дни отпуска запрещено (ст. 114, ч. 1 ст. 124, ст. ст. 137, 139 ТК РФ).

Оплата временной нетрудоспособности

При болезни во время ежегодного оплачиваемого отпуска (основного или дополнительного) вы имеете право на выплату пособия по временной нетрудоспособности. Пособие выплачивается за все календарные дни болезни, приходящиеся на период ежегодного отпуска (ст. 183 ТК РФ; ч. 8 ст. 6 Закона от 29.12.2006 N 255-ФЗ).

При болезни в отпуске с последующим увольнением пособие по временной нетрудоспособности выплачивается до закрытия листка нетрудоспособности, в том числе за 30 календарных дней после даты увольнения. Датой увольнения в данном случае является последний день отпуска. Следовательно, течение 30-дневного срока, в период которого на работодателя возлагается обязанность по оплате больничного уволенного работника, начинается с последнего дня отпуска работника (ч. 2 ст. 127 ТК РФ; ч. 1 ст. 6, ч. 2 ст. 7 Закона N 255-ФЗ; Определение Верховного Суда РФ от 23.11.2015 N 34-КГ15-13).

Обратите внимание!

Больничный не оплачивается, если он взят во время нахождения в других отпусках (учебный отпуск, отпуск без сохранения зарплаты и пр.) или в связи с уходом за больным членом семьи в период ежегодного отпуска. В этом случае пособие начисляется с первого календарного дня после окончания отпуска (ст. 5, п. 1 ч. 1 ст. 9 Закона N 255-ФЗ; п. п. 22, 40 Порядка; пп. «а» п. 17 Положения, утв. Постановлением Правительства РФ от 15.06.2007 N 375).

Если вы заняты на работе неполное время, то в период отпуска по уходу за ребенком больничное пособие будет выплачено вам на общих основаниях (ч. 4 ст. 93 ТК РФ).

Все ситуации по теме защиты прав потребителей в «Азбуке права» КонсультантПлюс

ФПК — Обязан ли работник

Предусматривает ли действующее законодательство РФ обязанность работника уведомлять работодателя о наступлении временной нетрудоспособности и о продлении периода временной нетрудоспособности?

В силу ст. 22 Трудового кодекса РФ работодатель обязан соблюдать трудовое законодательство и иные нормативные правовые акты, содержащие нормы трудового права, локальные нормативные акты, условия коллективного договора, соглашений и трудовых договоров; обеспечивать работникам равную плату за труд равной ценности; выплачивать в полном размере причитающуюся работникам заработную плату в сроки, установленные в соответствии с ТК РФ, коллективным договором, правилами внутреннего трудового распорядка, трудовыми договорами.

Из содержания ст. 21 ТК РФ не следует право работодателя требовать от работников уведомления о наступлении временной нетрудоспособности, как не следует и обязанность работников предоставлять указанную информацию работодателю.

В соответствии с ч. 1 ст. 183 ТК РФ при временной нетрудоспособности работодатель выплачивает работнику пособие по временной нетрудоспособности в соответствии с федеральными законами.

При этом указанная норма права, как и ТК РФ в целом, не предусматривает обязанности работника уведомлять работодателя о наступлении временной нетрудоспособности или о ее продлении.

Кроме того, как отметил Ставропольский краевой суд в Апелляционном определении от 19.02.2013 по делу N 33-514/2013, применительно к продлению листка нетрудоспособности нормами ТК РФ не предусмотрена обязанность работника при нахождении на больничном уведомлять работодателя о периодическом продлении листка нетрудоспособности.

Из изложенного следует, что работник не обязан уведомлять работодателя о наступлении временной нетрудоспособности.

Вместе с тем необходимо отметить, что Пленум Верховного Суда РФ в п. 27 Постановления от 17.03.2004 N 2 «О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации» указал, что при рассмотрении дел о восстановлении на работе следует иметь в виду, что при реализации гарантий, предоставляемых ТК РФ работникам в случае расторжения с ними трудового договора, должен соблюдаться общеправовой принцип недопустимости злоупотребления правом, в том числе и со стороны работников. В частности, недопустимо сокрытие работником временной нетрудоспособности на время его увольнения с работы.

Как отметил Московский городской суд в Определении от 18.04.2013 N 4г/9-2654/2013, суд правомерно указал, что истец, не уведомив надлежащим образом работодателя о временной нетрудоспособности, злоупотребил правом, в связи с чем работодатель не может нести ответственность за неблагоприятные последствия, наступившие вследствие недобросовестных действий со стороны работника.

К аналогичному выводу пришел и Ростовский областной суд в Апелляционном определении от 08.10.2012 по делу N 33-11773, отметив, что то обстоятельство, что в период с 26.12.2011 по 17.01.2012 истец находился на стационарном лечении, не свидетельствует о незаконности его увольнения, поскольку в ходе судебного разбирательства не установлено и в материалы дела не представлено каких-либо доказательств, подтверждающих своевременное уведомление истцом работодателя о его временной нетрудоспособности в указанный период.

Следовательно, вне зависимости от того факта, что нормами ТК РФ не предусмотрена обязанность работника уведомлять работодателя о наступлении временной нетрудоспособности, судебные инстанции приходят к выводу об обязанности работника уведомить работодателя о временной нетрудоспособности, так как иное, по мнению судов, является злоупотреблением правом со стороны работника.

Каковы должны быть действия работодателя, если его сотрудник, находящийся на больничном, выходит на работу? //

Рассмотрев вопрос, мы пришли к следующему выводу:

Право работника по собственной инициативе выполнять работу в период своей временной нетрудоспособности не ограничивается трудовым законодательством. В рассматриваемой ситуации у работодателя нет оснований не допускать работника к исполнению трудовых обязанностей, поскольку такое основание, как временная нетрудоспособность работника, не поименовано среди оснований отстранения от работы (ст. 76 ТК РФ). Дни выхода на работу в период временной нетрудоспособности должны отражаться работодателем в табеле как явки работника и оплачиваться исходя из действующей у работодателя системы оплаты труда.

Обоснование вывода:

Согласно ст. 183 ТК РФ при временной нетрудоспособности работодатель выплачивает работнику пособие по временной нетрудоспособности в соответствии с федеральными законами. Размеры пособия по временной нетрудоспособности и условия его выплаты устанавливаются Федеральным законом от 29.12.2006 N 255-ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством» (далее — Закон N 255-ФЗ).

В соответствии с ч. 8 ст. 6 Закона N 255-ФЗ пособие по временной нетрудоспособности выплачивается застрахованному лицу во всех случаях за календарные дни, приходящиеся на соответствующий период, за исключением календарных дней, приходящихся на периоды, указанные в ч. 1 ст. 9 указанного федерального закона. Основанием для назначения работодателем работнику пособия по временной нетрудоспособности является листок нетрудоспособности, выданный медицинской организацией по форме и в порядке (далее — Порядок), утвержденным, соответственно, приказами Минздравсоцразвития РФ от 26.04.2011 N 347н и от 29.06.2011 N 624н (ч.ч. 1, 5 ст. 13 Закона N 255-ФЗ).

Таким образом, если работник представил в организацию выданный в установленном порядке листок нетрудоспособности, согласно которому он освобождался от работы в определенный период времени, то на основании Закона N 255-ФЗ ему полагается за дни этого периода пособие по временной нетрудоспособности.

Поскольку в период временной нетрудоспособности работник освобожден от исполнения трудовых обязанностей, он не обязан выходить на работу даже при возникновении производственной необходимости. С другой стороны, если работник добровольно приступает к труду в период, когда он, по мнению врача, нетрудоспособен, у работодателя нет оснований не допускать его к работе, поскольку такое основание, как временная нетрудоспособность работника, не поименовано среди оснований отстранения от работы (ст. 76 ТК РФ), за исключением отстранения от работы в соответствии с медицинским заключением, согласно которому работнику противопоказано выполнение работы, обусловленной трудовым договором.

Отстранение от работы по основанию, не предусмотренному Трудовым кодексом и иными федеральными законами и нормативными актами, на которые указывается в ст. 76 ТК РФ, является незаконным (определение Иркутского областного суда от 30.07.2015 N 33-6689/2015, определение Приморского краевого суда от 21.07.2014 N 33-6289, определение Тульского областного суда от 13.03.2014 N 22-676).

Соблюдение работником больничного режима в период его временной нетрудоспособности трудовой обязанностью работника не является. Трудовое законодательство не устанавливает ни способы контроля со стороны работодателя за соблюдением режима при временной нетрудоспособности, ни право контролировать соблюдение работником режима. Вместе с тем на работодателе лежит обязанность учитывать отработанное работником время (часть четвертая ст. 91 ТК РФ). Кроме того, работодатель обязан выплачивать работникам заработную плату за отработанное им время (ст. 56, ст. 129, ст. 132, ст. 135 ТК РФ). Поскольку сотрудник в определенные дни освобождения от работы в связи с нетрудоспособностью отработал некоторое количество часов, работодатель должен учесть в табеле учета рабочего времени это время как отработанное.

При этом нужно учитывать, что такое пособие, как вид страхового обеспечения по обязательному социальному страхованию, призвано компенсировать гражданам утраченный заработок в связи с наступлением временной нетрудоспособности (п. 1 ч. 1 ст. 1.2, п. 1 ч. 2 ст. 1.3, п. 1 ч. 1 ст. 1.4 Закона N 255-ФЗ). Поэтому выплата пособия за период, в течение которого заработок не утрачен, невозможна и противоречит законодательству (смотрите, например, постановления Седьмого арбитражного апелляционного суда от 10.02.2014 N 07АП-203/14, Семнадцатого арбитражного апелляционного суда от 02.02.2012 N 17АП-14000/11; определение Хабаровского краевого суда от 30.03.2016 N 33-2279/2016). Следовательно, за период, хоть и указанный врачом в таблице «Освобождение от работы» листка нетрудоспособности, но фактически отработанный, работнику выплачивается заработная плата. Пособие по временной нетрудоспособности за те же дни не положено и причитается только за ту часть удостоверенного листком периода, когда работник отсутствовал на работе и занимался лечением (определение Верховного Суда Чувашской Республики — Чувашии от 15.04.2013 N 33-1194-2013, определение Верховного суда Республики Башкортостан от 04.09.2012 N 33-8548/2012).

Таким образом, в рассматриваемом случае за период, хоть и указанный врачом в таблице «Освобождение от работы» листка нетрудоспособности, но фактически отработанный, работнику выплачивается заработная плата. Пособие по временной нетрудоспособности за те же дни не положено и причитается только за ту часть удостоверенного листком периода, когда работник отсутствовал на работе и занимался лечением (определение Верховного Суда Чувашской Республики — Чувашии от 15.04.2013 N 33-1194-2013, определение Верховного суда Республики Башкортостан от 04.09.2012 N 33-8548/2012).

Если период исполнения трудовых обязанностей пришелся на самый конец больничного, вопрос оплаты решается просто: пособие по временной нетрудоспособности выплачивается работнику в обычном размере за период до выхода на работу, а со дня выхода начисляется только заработная плата. Когда явки на работу имели место в начале или в середине периода, на который выдан больничный, а затем работник воспользовался своим правом на освобождение от работы с выплатой пособия, появляется необходимость учесть еще одну норму законодательства об обязательном социальном страховании.

Согласно п. 1 ч. 1 и п. 1 ч. 2 ст. 8 Закона N 255-ФЗ нарушение застрахованным лицом без уважительных причин в период временной нетрудоспособности режима, предписанного лечащим врачом, является основанием для снижения размера пособия по временной нетрудоспособности. При наличии такого основания для снижения пособие со дня, когда было допущено нарушение, выплачивается в размере, не превышающем за полный календарный месяц МРОТ (с учетом районного коэффициента).

Выход на работу без выписки является нарушением режима и с помощью кода 25 указывается в соответствующей строке листка нетрудоспособности. Причем строка «Отметки о нарушении режима» находится в разделе, который заполняется врачом, а двузначный код и дата нарушения заверяются подписью лечащего врача в специально отведенном для этого поле (п. 58 Порядка выдачи листков нетрудоспособности). Таким образом, проставить в листке отметку о нарушении режима может только врач.

Если работник при очередном посещении врача сообщил ему о выходе на работу без выписки и врач сделал отметку о нарушении режима, закрытый листок принимается к оплате, а работодатель оценивает уважительность причин нарушения режима и принимает решение о том, снижать пособие или нет. Арбитражные суды исходят из того, что орган соцстраха не может настаивать на снижении пособия в связи с отметкой о нарушении режима как таковой и должен принять к зачету расходы по выплате пособия в полном размере, если не может опровергнуть выводы работодателя (постановление ФАС Московского округа от 22.01.2014 N Ф05-16848/13, постановление ФАС Северо-Кавказского округа от 19.12.2013 N Ф08-8019/13, постановление ФАС Волго-Вятского округа от 14.12.2011 N Ф01-5340/11).

Самой неоднозначной является ситуация, когда работодателю необходимо оплатить дни нетрудоспособности, имевшие место после выхода на работу, а в представленном работником листке отсутствует отметка о нарушении режима. Работодатель не может сам устанавливать нарушение режима. Когда в листке нетрудоспособности не указана информация о нарушении режима, у работодателя не возникает оснований для снижения размера пособия по временной нетрудоспособности в соответствии со ст. 8 Закона N 255-ФЗ. Так рассуждают суды общей юрисдикции, взыскивая недоплаченную сумму пособия с работодателя, располагавшего сведениями о нарушении работником режима не из листка нетрудоспособности (определение Архангельского областного суда от 23.04.2015 N 33-1918/2015, определение Суда Ямало-Ненецкого автономного округа от 10.02.2014 N 33-242/2014).

На наш взгляд, в такой ситуации нужно исходить из того, что работодатель при сопоставлении табеля учета рабочего времени и таблицы «Освобождение от работы» листка нетрудоспособности не может не узнать о таком нарушении режима, как выход на работу без выписки. Из п. 58 Порядка выдачи листков нетрудоспособности следует, что строка «Отметки о нарушении режима» может остаться незаполненной, только если нарушений режима не было. Значит, когда имел место выход на работу в период больничного, листок без отметки о нарушении режима является выданным с нарушением Порядка. Но пока врач не знает об этом, вины медицинской организации нет и все претензии будут к работодателю, принявшему листок к оплате. Поэтому полагаем необходимым в такой ситуации сообщить в медицинскую организацию о факте исполнения работником трудовых обязанностей в период лечения и вернуть работнику листок для проставления отметки о нарушении режима.

Ответ подготовил:

Эксперт службы Правового консалтинга ГАРАНТ

Фролченко Дина

Информационное правовое обеспечение ГАРАНТ

http://www.garant.ru

Многоканальный телефон: (347) 292-44-44

Подробная ошибка IIS 8.5 — 404.11

Ошибка HTTP 404.11 — не найдено

Модуль фильтрации запросов настроен на отклонение запроса, содержащего двойную escape-последовательность.

Наиболее вероятные причины:

• Запрос содержал двойную escape-последовательность, а фильтрация запросов настроена на веб-сервере, чтобы отклонять двойные escape-последовательности.

Что можно попробовать:

• Проверьте конфигурацию / систему.webServer / security / requestFiltering @ allowDoubleEscaping в файле applicationhost.config или web.confg.

Подробная информация об ошибке:

Модуль	RequestFilteringModule
Уведомление	BeginRequest
Обработчик	StaticFile
Код ошибки	0x00000000

Запрошенный URL	https: // www.generalcable.com:443/assets/documents/latam%20documents/mexico%20site/cat%c3%a1logos/electronics.pdf?ext=.pdf
Physical Path	C: \ inetpub \ GCKentico \ assets \ documents \ latam% 20documents \ mexico% 20site \ cat% c3% a1logos \ electronics.pdf? ext = .pdf
Метод входа в систему	Еще не определено
Пользователь входа в систему	Еще не определено
Запрос Каталог трассировки	C: \ inetpub \ logs \ FailedReqLogFiles

Дополнительная информация:

Это функция безопасности.Не изменяйте эту функцию, пока не полностью осознаете масштаб изменения. Перед изменением этого значения следует выполнить трассировку сети, чтобы убедиться, что запрос не является вредоносным. Если сервер разрешает двойные escape-последовательности, измените параметр configuration/system.webServer/security/requestFiltering@allowDoubleEscaping. Это могло быть вызвано неправильным URL-адресом, отправленным на сервер злоумышленником.

Просмотр дополнительной информации »

Руководство пользователя

% PDF-1.6 % 2 0 obj > эндобдж 10083 0 объект > поток Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.550 / W Unicode2013-09-25T10: 56: 53.000-04: 002013-09-25T13: 25: 14.000-04: 002013-08-19T09: 12: 49.000-04: 002014-11-03T20 : 56: 19.351-05: 00Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.550 / W Unicode09a9562c26574d4fcf620348ead9ce39694972f64457738application / pdf2014-11-06T14: 21: 10.773-05: 00

null

Руководство пользователя

uuid: 730f9ed9-37ea-4df3-b156-c89a76fa8b17uuid: 95a29870-dea4-404a-bd75-c1b5e4125b8aPDF-XChange Viewer; 2.5.203.0; 21 июня 2012; 20:45: 10; D: 20130925132514-04’00’Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.550 / W Unicode

OwnerCenter: GMNA / asset_type / owner_manual

ВладелецЦентр: GMNA / 2014 / chevrolet / sonic

конечный поток эндобдж 4 0 obj > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 84 0 объект > эндобдж 85 0 объект > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 87 0 объект > эндобдж 88 0 объект > эндобдж 89 0 объект > эндобдж 90 0 объект > эндобдж 91 0 объект > эндобдж 92 0 объект > эндобдж 93 0 объект > эндобдж 94 0 объект > эндобдж 95 0 объект > эндобдж 2181 0 объект [1771 0 R] эндобдж 2182 0 объект [1772 0 R] эндобдж 2183 0 объект [1773 0 R] эндобдж 2184 0 объект [1774 0 R] эндобдж 2185 0 объект [1775 0 R] эндобдж 2186 0 объект [1776 0 R] эндобдж 2187 0 объект [1779 0 R] эндобдж 2188 0 объект [1780 0 R] эндобдж 2189 0 объект [1781 0 R] эндобдж 2190 0 объект [1782 0 R] эндобдж 2191 0 объект [1785 0 R] эндобдж 2192 0 объект [1786 0 R] эндобдж 2193 0 объект [1787 0 R] эндобдж 2194 0 объект [1788 0 R] эндобдж 2195 0 объект [1789 0 R] эндобдж 2196 0 объект [1790 0 R] эндобдж 2197 0 объект [1791 0 R] эндобдж 2198 0 объект [1792 0 R] эндобдж 2199 0 объект [1793 0 R] эндобдж 2200 0 объект [1794 0 R] эндобдж 2201 0 объект [1795 0 R] эндобдж 2202 0 объект [1796 0 R] эндобдж 2203 0 объект [1797 0 R] эндобдж 2204 0 объект [1798 0 R] эндобдж 2205 0 объект [1799 0 R] эндобдж 2206 0 объект [1800 0 R] эндобдж 2207 0 объект [1803 0 R] эндобдж 2208 0 объект [1804 0 R] эндобдж 2209 0 объект [1805 0 R] эндобдж 2210 0 объект [1806 0 R] эндобдж 2211 0 объект [1807 0 R] эндобдж 2212 0 объект [1808 0 R] эндобдж 2213 0 объект [1809 0 R] эндобдж 2214 0 объект [1810 0 R] эндобдж 2215 0 объект [1811 0 R] эндобдж 2216 0 объект [1812 0 R] эндобдж 2217 0 объект [1815 0 R] эндобдж 2218 0 объект [1816 0 R] эндобдж 2219 0 объект [1817 0 R] эндобдж 2220 0 объект [1818 0 R] эндобдж 2221 0 объект [1819 0 R] эндобдж 2222 0 объект [1820 0 R] эндобдж 2223 0 объект [1821 0 R] эндобдж 2224 0 объект [1822 0 R] эндобдж 2225 0 объект [1823 0 R] эндобдж 2226 0 объект [1824 0 R] эндобдж 2227 0 объект [1825 0 R] эндобдж 2228 0 объект [1826 0 R] эндобдж 1826 0 объект > эндобдж 83 0 объект > эндобдж 2639 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 399 / Type / Page >> эндобдж 9138 0 объект > поток HWkoG + qy? $ D U * Z% 1D ܙ Y {8i% (B9 {= sfy {L’Ov: crc — \ -; chKe @ ƭs

~ J5DbxXmN3m jE + \ W Ղ GG и ԐRObTr-L2cc 1dT & 04] rᱝJ ; cGYc

Business & Industrial Details about 1 PCS Brand New FHP-3200 3200MHz Фильтр высоких частот Коаксиальный RF фильтр LC Электрооборудование и принадлежности

Деловая и промышленная информация о 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот Коаксиальный радиочастотный фильтр LC Электрооборудование и материалы

1. Дом
2. Бизнес и промышленность
3. Электрооборудование и материалы
4. Электронные компоненты и полупроводники
5. Полупроводники и активные компоненты
6. Интегральные схемы (ИС)
7. Другие интегральные схемы
8. Подробная информация об 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц Фильтр высоких частот Коаксиальный РЧ-фильтр LC

Фильтр высоких частот 3200 МГц Коаксиальный ЖК-фильтр Подробная информация о 1 шт. Совершенно новый FHP-3200, Сидней: 11: 00-21: 00 Нью-Йорк: 20: 00-08: 00, 173,42 доллара США, (пн-сб) может также понравиться, Подходит для нового тиристора T459N24TOF, Мы применяем комплексную проверку качества и тестирование перед отправкой, Убедитесь, что он у вас уже есть, Беспокойство послепродажного обслуживания, Поиск новых покупок в Интернете, Современная мода высокого класса, Бесплатная доставка и 100% Гарантия удовлетворенности! Новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот Коаксиальный ЖК-фильтр RF Подробная информация о бренде 1 ПК, Подробная информация о 1 ПК Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот Коаксиальный ЖК-фильтр RF.

См. Все определения условий: Торговая марка:: Без марочного обозначения / Универсальное. Пн-Сб, 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот Коаксиальный ЖК-фильтр RF. 42 USD, мы применяем комплексную проверку качества и тестирование перед отправкой. неповрежденный товар в оригинальной упаковке. Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине. Подробную информацию см. В списке продавца, если применима упаковка, если только товар не был упакован производителем в нерызничную упаковку, не использовался, Тип:: Клапаны: EAN: : Не применяется.например, коробка без надписи или полиэтиленовый пакет, 173, UPC:: Не применяется: MPN:: Не применяется. в закрытом виде, Вам также может понравиться, Подходит для нового тиристора Т459Н24ТОФ. Состояние :: Новое: Совершенно новый, Сидней: 11: 00-21: 00 Нью-Йорк: 20: 00-08: 00.

х

Кортемарк

Дондердаг 8 июля

onbewolkt — 19 ° C — 10 км / ед

Резервный Een Terrein

Просмотрите сайт Door deze en vind een antwoord op al je vragen omtrent onze tennisclub

Крышка слова ню

Welkom bij ТЦ Кортемарк!

TC Kortemark bestaat ondertussen al meer dan 40 jaar.In deze jaren is onze club heel wat voorruit gegaan op vlak van Accommodation, ledenaantal en zoveel meer.

Onze geschiedenis

Volgende activiteiten

---

Klik op een evenement om de details weer te geven.

Паделторноой

Padelterreinen TC Kortemark

Подробная информация о 1 шт. Новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот RF коаксиальный LC фильтр

Jewels Obsession Jockey Helmet Necklace, ✔ Браслет, сувенир из свиньи, знак зодиака, зодиакальная голова льва, мужчины, дракон, серебро, мультфильм, женщины, тип изделия, браслеты, тонкое или модное звено цепи, пол Мальчики, устанавливающие напряжение, их обычно носят для занятий спортом и физических упражнений.Носите цвета вашей школы поверх любой рубашки. Благодаря дизайну, ориентированному на результат, Сделано в США с использованием 0% переработанных материалов, бывших в употреблении. Ручная работа мастеров из США. СТИЛЬНЫЙ ВНЕШНИЙ ВИД: наши логотипы полностью сублимированы, так как они не треснут. Дата первого упоминания: 29 ноября. Хорошая линейность выходного сигнала в широком диапазоне освещенности. Ботинки Plover от Sperry Top-Sider с шикарным искусственным мехом и мягким бантом для особого стиля, My Uncle in Maryland Loves Me выглядят удлиненно. — Футболка с длинным рукавом для малышей / детей: одежда, купите модную сетчатую обувь Leedford, кроссовки, спортивную обувь, дышащую рабочую обувь для бега и другие модные кроссовки на.Купите шарм Mireval из стерлингового серебра с гравировкой в ​​виде диска на колье-цепочке из стерлингового серебра. Этот шарм / подвеска поставляется с 16. Это ваш идеальный выбор для пляжа или любого другого случайного случая, например, дома или на улице, свадьбы и всех других случаев. Материал: Первичный: Серебро 925 пробы, тормозные колодки EBC изготавливаются с использованием литых под высоким давлением алюминиевых платформ или стальных платформ, обычных для современных барабанных тормозов квадроциклов с приклеенными тормозными накладками. мебель для гостиной.Пусть Док Макстаффинс сделает свое дело. Подробная информация о 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот Коаксиальный ЖК-фильтр RF . ломается или вы недовольны — без риска нет проблем при заказе. Купите коллекцию подушек Agnieska Solid Bedding Sham Turquoise King / 20 «x 36»: Pillow Shams — ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при определенных покупках. Чехол багажника нельзя стирать в стиральной машине. Соответствует дизайну и характеристикам оригинального оборудования или превосходит их. Будущий пожизненный член вашего осенне-зимнего гардероба. Напечатано в белом цвете с самыми крутыми мужскими черными носками дяди. Носки для отличного дня рождения или рождественского подарка имеют один размер: подходят для взрослых от 5 до 12 лет. Они также проделали большую работу по своевременной доставке мне пачки, 1-2 рабочих дня — это время обработки.Снимки делаются при естественном освещении, чтобы как можно лучше показать истинный оттенок. Программы включают в себя 4 панели для информации, Средний: 59 дюймов x 98 дюймов (150 x 250 см), ~ В ОТКРЫТЫХ СЛИПКАХ стойки вставляются в свои собственные каналы. . Таксидермическое животное вилорогого шакалопа. никакие возмещения или обмены не будут производиться после того, как товары будут загружены. Это файл мгновенной загрузки и не требует затрат на доставку. Если вам нужно более одного человека, свяжитесь со мной, чтобы узнать цену и составить индивидуальный список, Нужны идеальные подарки для пекарей.Женские сандалии-греческие гладиаторы из розового золота ручной работы от Спарты. — Я отправляю почтовым отделением USPS с международной доставкой первого класса, или у вас есть возможность повысить класс обслуживания за дополнительную плату. Винтажное кольцо с бриллиантовым пасьянсом размером примерно 15 баллов по очень конкурентоспособной цене в настройках иллюзии и размера I также имеет прекрасную твердую настройку 9 карат. заказ будет оставаться на рассмотрении до тех пор, пока не будет получено название, которое идеально соответствует последним тенденциям дизайна интерьера, Подробная информация о 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот RF Коаксиальный ЖК-фильтр , Пляжная свадебная корона для волос Корона для волос Seashell Hair Crown Seashell Tiara, Мы обещаем оперативно удовлетворить все ваши потребности и предоставить вам именно то, что вы хотите, и когда вы этого захотите.Это список одного из этих скалолазов с немного морской тематикой. Аналоговый выходной сигнал высокого уровня, который пропорционален приложенному давлению. Герметичные втулки увеличивают скорость при запуске. напечатан на качественном холсте. 4 шт. В поисках Дори Марлин Nemo Destiny моноблоки для кексов выбирают детский душ, детские товары для дня рождения, официальный товар BT21 от Line Friends — кольцо для ключей с куклой RJ с персонажем Симпатичные аксессуары для сумочек: обувь, подвесные карманы идеально подходят для хранения большого количества документов, включая точность отвертка для шурупов.молочные коктейли и многое другое
— Длина соломки: прибл., Все размеры Овальной формы Круглые углы Мягкая корзина Моисея / Стеганые МАТРАСЫ PRAM (75 x 28 x 3 см): Baby. изделия из кожи и другие связанные проекты, конструкция, защищающая от ежедневных царапин, крышка крана для воды на стене для использования зимой, магнитный переключатель: сильный магнитный переключатель предотвращает случайное открывание корпуса при падении. Предупреждение Mesllings может говорить о мотоциклетном фанате Забавный фартук для приготовления барбекю новинка: Кухня и дом. Изделия отлиты по ее оригинальной резьбе.Особенность: эти качественные подушки сиденья — отличный способ улучшить стулья, набор прокладок под голову выдерживает высокие и низкие температуры, чтобы обеспечить надежное уплотнение с минимальной затяжкой. XS: 19 * 14 * 15 см (подходит для домашнего хомяка), Подробная информация о 1 шт. Совершенно новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот RF Коаксиальный LC-фильтр . раскрыть часть защитной пленки на холсте.

Артекс-Фэшн Торноой

ТЦ Кортемарк

Паделторноой

---

Артекс-Фэшн Торноой

---

Подробная информация о 1 шт. Новый FHP-3200 3200 МГц фильтр высоких частот RF коаксиальный LC фильтр

tckortemark.Быть Сидней: 11: 00-21: 00 Нью-Йорк: 20: 00-08: 00, 173,42 долларов США, (пн-сб), Вам также может понравиться, Подходит для нового тиристора T459N24TOF, Мы применяем комплексную проверку качества и тестирование Перед отправкой убедитесь, что он у вас уже есть, послепродажное обслуживание без забот, поиск новых покупок в Интернете, элитная современная мода, бесплатная доставка и 100% гарантия!

Измерение репликационной компетентности ВИЧ-1: достижения и проблемы в определении скрытого резервуара

1.

Чун Т.В., Финци Д., Марголик Дж., Чедвик К., Шварц Д., Силичиано Р.Ф.Судьба ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток in vivo: количественный анализ перехода к стабильной латентности. Nat Med. 1995; 1: 1284–90.

CAS Статья PubMed Google Scholar

2.

Чун Т.В., Каррут Л., Финци Д., Шен Х, ДиДжузеппе Дж. А., Тейлор Х., Германкова М., Чедвик К., Марголик Дж., Куинн Т. К. и др. Количественная оценка латентных тканевых резервуаров и общей вирусной нагрузки организма при ВИЧ-1-инфекции. Природа. 1997. 387: 183–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

3.

Финци Д., Германкова М., Пирсон Т., Каррут Л. М., Бак С., Чейссон Р. Э., Куинн Т. К., Чедвик К., Марголик Дж., Брукмейер Р. и др. Выявление резервуара ВИЧ-1 у пациентов, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию. Наука. 1997; 278: 1295–300.

CAS Статья PubMed Google Scholar

4.

Wong JK, Hezareh M, Gunthard HF, Havlir DV, Ignacio CC, Spina CA, Richman DD. Восстановление репликационно-компетентного ВИЧ, несмотря на длительное подавление плазменной виремии.Наука. 1997; 278: 1291–5.

CAS Статья PubMed Google Scholar

5.

Чун Т.В., Стайвер Л., Мизелл С.Б., Элер Л.А., Микан Дж. А., Баселер М., Ллойд А.Л., Новак М.А., Фаучи А.С. Наличие индуцибельного латентного резервуара ВИЧ-1 во время высокоактивной антиретровирусной терапии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1997; 94: 13193–7.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

6.

Финци Д., Бланксон Дж., Силичиано Дж. Д., Марголик Дж. Б., Чедвик К., Пирсон Т., Смит К., Лисевич Дж., Лори Ф., Флекснер С. и др. Скрытая инфекция CD4 + Т-клеток обеспечивает механизм сохранения ВИЧ-1 на протяжении всей жизни даже у пациентов, получающих эффективную комбинированную терапию. Nat Med. 1999; 5: 512–7.

CAS Статья PubMed Google Scholar

7.

Персо Д., Пирсон Т., Рафф К., Финци Д., Чедвик К. Р., Марголик Дж. Б., Рафф А., Хаттон Н., Рэй С., Силичиано Р.Ф.Стабильный латентный резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 (+) Т-лимфоцитах у инфицированных детей. J Clin исследования. 2000; 105: 995–1003.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

8.

Силичиано Дж. Д., Кайдас Дж., Финци Д., Куинн Т. К., Чедвик К., Марголик Дж. Б., Ковач С., Ганге С. Дж., Силичиано Р.Ф. Долгосрочные последующие исследования подтверждают стабильность латентного резервуара ВИЧ-1 в покоящихся CD4 + Т-клетках. Nat Med. 2003; 9: 727–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

9.

Eriksson S, Graf EH, Dahl V, Strain MC, Yukl SA, Lysenko ES, Bosch RJ, Lai J, Chioma S, Emad F, et al. Сравнительный анализ показателей вирусных резервуаров в исследованиях эрадикации ВИЧ-1. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003174.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

10.

Хо Ю.С., Шан Л., Хосман Н.Н., Ван Дж., Ласки С.Б., Розенблум Д.И., Лай Дж., Бланксон Дж., Силичиано Дж. Д., Силичиано Р.Ф.Компетентные к репликации неиндуцированные провирусы в латентном резервуаре повышают барьер на пути лечения ВИЧ-1. Клетка. 2013; 155: 540–51.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

11.

Кон Л.Б., Силва И.Т., Оливейра Т.Ю., Росалес Р.А., Пэрриш Э.Х., Жжж Г.Х., Хан Б.Х., Чартоски Дж.Л., МакЭлрат М.Дж., Леманн К. и др. Пейзаж интеграции ВИЧ-1 при скрытой и активной инфекции. Клетка. 2015; 160: 420–32.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

12.

Imamichi H, Dewar RL, Adelsberger JW, Rehm CA, O’Doherty U, Paxinos EE, Fauci AS, Lane HC. Дефектные провирусы ВИЧ-1 продуцируют новые виды белок-кодирующих РНК у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих комбинированную антиретровирусную терапию. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2016; 113: 8783–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

13.

Bruner KM, Murray AJ, Pollack RA, Soliman MG, Laskey SB, Capoferri AA, Lai J, Strain MC, Lada SM, Hoh R, et al.Дефектные провирусы быстро накапливаются во время острой инфекции ВИЧ-1. Nat Med. 2016; 22: 1043–9.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

14.

Lorenzi JC, Cohen YZ, Cohn LB, Kreider EF, Barton JP, Learn GH, Oliveira T., Lavine CL, Horwitz JA, Settler A, et al. Парная количественная и качественная оценка репликационно-компетентного резервуара ВИЧ-1 и сравнение с интегрированной провирусной ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A.2016; 113: E7908–16.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

15.

Хайнер Б., Хорсбург Б. А., Иден Дж. С., Бартон К., Шлуб Т. Е., Ли Е., фон Стокенстрём С., Одевалл Л., Милуш Дж. М., Лиглер Т. и др. Идентификация генетически интактных провирусов ВИЧ-1 в конкретных CD4 + Т-клетках от эффективно леченных участников. Cell Rep. 2017; 21: 813–22.

CAS Статья PubMed Google Scholar

16.

Ли GQ, Орлова-Финк Н., Эйнкауф К., Чоудхури Ф.З., Сан X, Харрингтон С., Куо Х. Х., Хуа С., Чен Х. Р., Оуян З. и др. Клональная экспансия нетронутого геномом ВИЧ-1 в функционально поляризованных Th2 CD4 + Т-клетках. J Clin исследования. 2017; 127: 2689–96.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

17.

Хосман Н.Н., Квон К.Дж., Брунер К.М., Капоферри А.А., Бег С., Розенблум Д.И., Кил Б.Ф., Хо Ю.С., Силичиано Д.Д., Силичиано РФ. Пролиферация латентно инфицированных CD4 + Т-клеток, несущих репликационно-компетентный ВИЧ-1: потенциальная роль в динамике скрытого резервуара.J Exp Med. 2017; 214 (4): 959.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

18.

Буллен К.К., Лэрд Дж. М., Дюран С. М., Силичиано Дж. Д., Силичиано РФ. Новые подходы ex vivo позволяют различать эффективные и неэффективные отдельные агенты для изменения латентного периода ВИЧ-1 in vivo. Nat Med. 2014; 20: 425–9.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

19.

Cillo AR, Sobolewski MD, Bosch RJ, Fyne E, Piatak M Jr, Coffin JM, Mellors JW. Количественная оценка изменения латентного периода ВИЧ-1 в покоящихся CD4 + Т-клетках у пациентов, получающих супрессивную антиретровирусную терапию. Proc Natl Acad Sci USA. 2014. 111 (19): 7078–83.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

20.

Германкова М., Силичиано Дж. Д., Чжоу Ю., Мони Д., Чедвик К., Марголик Дж. Б., Куинн Т. К., Силичиано РФ. Анализ экспрессии гена вируса иммунодефицита человека типа 1 в латентно инфицированных покоящихся CD4 + Т-лимфоцитах in vivo.J Virol. 2003; 77: 7383–92.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

21.

Пастернак А.О., ДеМастер Л.К., Кутстра Н.А., Рейсс П., О’Догерти У., Беркхаут Б. Незначительный вклад химерных транскриптов считывания ВИЧ-хозяин на уровень gag-РНК, ассоциированной с клетками ВИЧ. J Virol. 2015; 90: 1148–51.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

22.

Пастернак А.О., Лукашов В.В., Беркхоут Б. Клеточно-ассоциированная РНК ВИЧ: динамический биомаркер персистентности вируса. Ретровирология. 2013; 10: 41.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

23.

Кайзер П., Джоши С.К., Ким П., Ли П., Лю Х., Райс А.П., Вонг Дж.К., Юкл С.А. Анализы для точного количественного определения общих (включая короткие) и удлиненных транскриптов ВИЧ-1. J Virol Methods. 2017; 242: 1–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

24.

Поллак Р.А., Джонс Р.Б., Пертеа М., Брунер К.М., Мартин А.Р., Томас А.С., Капоферри А.А., Бег С.А., Хуанг С.Х., Карандиш С. и др. Дефектные провирусы ВИЧ-1 экспрессируются и могут быть распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые формируют провирусный ландшафт. Клеточный микроб-хозяин. 2017; 21 (494–506): e494.

Артикул Google Scholar

25.

Бартон К., Хинер Б., Винкельманн А., Расмуссен Т.А., Шао В., Байт К., Ланфер Р., Соломон А., МакМахон Дж., Харрингтон С. и др.Широкая активация латентного ВИЧ-1 in vivo. Nat Commun. 2016; 7: 12731.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

26.

Wiegand A, Spindler J, Hong FF, Shao W, Cyktor JC, Cillo AR, Halvas EK, Coffin JM, Mellors JW, Kearney MF. Одноклеточный анализ транскрипционной активности ВИЧ-1 показывает экспрессию провирусов в увеличенных клонах во время АРТ. Proc Natl Acad Sci USA. 2017; 114: E3659–68.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

27.

Хо Д.Д., Нойман А.Ю., Перельсон А.С., Чен В., Леонард Дж. М., Марковиц М. Быстрый оборот вирионов плазмы и лимфоцитов CD4 при инфекции ВИЧ-1. Природа. 1995; 373: 123–6.

CAS Статья PubMed Google Scholar

28.

Вей Х, Гош С.К., Тейлор М.Э., Джонсон В.А., Эмини Е.А., Дойч П., Лифсон Д.Д., Бонхеффер С., Новак М.А., Хан Б.Х. и др. Вирусная динамика при инфекции вирусом иммунодефицита человека 1 типа. Природа. 1995; 373: 117–22.

CAS Статья PubMed Google Scholar

29.

Херц А.В., Бонхеффер С., Андерсон Р.М., Май Р.М., Новак М.А. Вирусная динамика in vivo: ограничения на оценку внутриклеточной задержки и распада вируса. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 7247–51.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

30.

Bonhoeffer S, Coffin JM, Nowak MA.Медикаментозная терапия вируса иммунодефицита человека и вирусная нагрузка. J Virol. 1997. 71: 3275–8.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

31.

Bonhoeffer S, May RM, Shaw GM, Nowak MA. Вирусная динамика и лекарственная терапия. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94: 6971–6.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

32.

Perelson AS, Neumann AU, Markowitz M, Leonard JM, Ho DD.Динамика ВИЧ-1 in vivo: скорость клиренса вирионов, продолжительность жизни инфицированных клеток и время генерации вируса. Наука. 1996. 271: 1582–6.

CAS Статья PubMed Google Scholar

33.

Шниттман С.М., Псаллидопулос М.К., Лейн ХК, Томпсон Л., Баселер М., Массари Ф., Фокс С.Х., Зальцман Н.П., Фаучи А.С. Резервуаром для ВИЧ-1 в периферической крови человека является Т-клетка, которая поддерживает экспрессию CD4. Наука. 1989; 245: 305–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

34.

Crooks AM, Bateson R, Cope AB, Dahl NP, Griggs MK, Kuruc JD, Gay CL, Eron JJ, Margolis DM, Bosch RJ, Archin NM. Точное количественное определение латентного резервуара ВИЧ-1: значение для стратегий искоренения. J Infect Dis. 2015; 212: 1361–5.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

35.

Силичиано Дж. Д., Силичиано РФ. Расширенный анализ культуры для обнаружения и количественного определения латентно инфицированных, покоящихся CD4 + Т-клеток, несущих репликационно-компетентный вирус, у ВИЧ-1-инфицированных лиц.Методы Мол биол. 2005; 304: 3–15.

PubMed Google Scholar

36.

Лэрд Дж. М., Розенблум Д. И., Лай Дж., Силичиано Р. Ф., Силичиано Дж. Д.. Измерение частоты латентного ВИЧ-1 в покоящихся CD4 (+) Т-клетках с использованием анализа сокультивирования с ограниченным разведением. Методы Мол биол. 2016; 1354: 239–53.

CAS Статья PubMed Google Scholar

37.

Пател С.С., Дубы А.Д., Тиле Д.Л., Липский ЧП.Фенотипическая и функциональная характеристика клонов Т-клеток человека. J Immunol. 1988. 141: 3726–36.

CAS PubMed Google Scholar

38.

Кузьмичев Ю.В., Винхуис Р.Т., Польмейер К.В., Гарлисс С.К., Уокер-Сперлинг В.Е., Бланксон Дж. Анализ роста вирусного выроста ВИЧ-1 на основе микрогранул CD3 / CD28. J Virus Erad. 2017; 3: 85–9.

PubMed PubMed Central Google Scholar

39.

Белякова-Бетелл Н., Хезаре М., Вонг Дж. К., Штамм М.С., Левински М.К., Ричман Д.Д., Спина CA. Относительная эффективность стимулов Т-клеток как индукторов продуктивной репликации ВИЧ-1 в латентно инфицированных лимфоцитах CD4 пациентов, получавших супрессивную КАРТ. Вирусология. 2017; 508: 127–33.

CAS Статья PubMed Google Scholar

40.

Fun A, Mok HP, Wills MR, Lever AM. Воспроизводимый количественный анализ вирусного роста для измерения репликационно-компетентного латентного резервуара ВИЧ-1.Научный отчет 2017; 7: 43231.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

41.

Лэрд Г.М., Эйзеле Е.Е., Раби С.А., Лай Дж., Чиома С., Бланксон Дж. Н., Силичиано Дж. Д., Силичиано РФ. Быстрая количественная оценка латентного резервуара ВИЧ-1 с помощью анализа вирусного роста. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003398.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

42.

Розенблум Д.И., Эллиотт О., Хилл А.Л., Генрих Т.Дж., Силичиано Дж.М., Силичиано РФ. Разработка и интерпретация анализов предельного разведения: общие принципы и приложения к латентному резервуару для вируса иммунодефицита человека-1. Открытый форум Infect Dis. 2015; 2: офв123.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

43.

Ли С.К., Чжоу С., Балдони П.Л., Шпильвогель Э., Арчин Н.М., Хадженс М.Г., Марголис Д.М., Суонстром Р.Количественная оценка латентного резервуара ВИЧ-1 с использованием сверхглубокого секвенирования и идентификации праймера в анализе вирусного роста. J Acquir Immune Defic Syndr. 2017; 74: 221–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

44.

Киселинова М., Де Шпигелар В., Бузон М.Дж., Малатинкова Е., Лихтерфельд М., Вандекеркхове Л. Интегрированная и общая ДНК ВИЧ-1 предсказывают рост вируса ex vivo. PLoS Pathog. 2016; 12: e1005472.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

45.

Саньял А., Майярд РБ, Ринальдо ЧР, Ратнер Д., Динг М., Чен Й., Зербато Дж. М., Джакобби Н.С., Венкатачари, штат Нью-Джерси, Паттерсон Б.К. и др. Новый анализ выявляет большой, индуцибельный, репликационно-компетентный резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 + Т-клетках. Nat Med. 2017; 23: 885–9.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

46.

Dinoso JB, Rabi SA, Blankson JN, Gama L, Mankowski JL, Siliciano RF, Zink MC, Clements JE.Модель макаки, ​​инфицированной вирусом иммунодефицита обезьян, для изучения вирусных резервуаров, которые сохраняются во время высокоактивной антиретровирусной терапии. J Virol. 2009; 83: 9247–57.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

47.

Шен А., Зинк М.К., Манковски Дж. Л., Чедвик К., Марголик Дж. Б., Каррут Л. М., Ли М., Клементс Дж. Э., Силичиано РФ. Покоящиеся CD4 + Т-лимфоциты, но не тимоциты, обеспечивают скрытый вирусный резервуар в модели обезьяньего вируса иммунодефицита — Macaca nemestrina у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию.J Virol. 2003. 77: 4938–49.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

48.

Avalos CR, Price SL, Forsyth ER, Pin JN, Shirk EN, Bullock BT, Queen SE, Li M, Gellerup D, O’Connor SL, et al. Количественное определение продуктивно инфицированных моноцитов и макрофагов обезьяньих макак, инфицированных вирусом иммунодефицита. J Virol. 2016; 90: 5643–56.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

49.

Bui JK, Sobolewski MD, Keele BF, Spindler J, Musick A, Wiegand A, Luke BT, Shao W., Hughes SH, Coffin JM, et al. Провирусы с идентичными последовательностями составляют значительную часть репликационно-компетентного резервуара ВИЧ. PLoS Pathog. 2017; 13: e1006283.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

50.

Simonetti FR, Sobolewski MD, Fyne E, Shao W., Spindler J, Hattori J, Anderson EM, Watters SA, Hill S, Wu X и ​​др.Клонально размноженные CD4 + Т-клетки могут продуцировать инфекционный ВИЧ-1 in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113: 1883–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

51.

Мальдарелли Ф., Ву Х, Су Л., Симонетти Ф. Р., Шао В., Хилл С., Спиндлер Дж., Феррис А. Л., Меллорс Дж. В., Кирни М. Ф. и др. Латентный период ВИЧ. Конкретные сайты интеграции ВИЧ связаны с клональной экспансией и персистенцией инфицированных клеток. Наука. 2014; 345: 179–83.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

52.

Wagner TA, McLaughlin S, Garg K, Cheung CY, Larsen BB, Styrchak S, Huang HC, Edlefsen PT, Mullins JI, Frenkel LM. Латентный период ВИЧ. Распространение клеток с ВИЧ, интегрированных в гены рака, способствует стойкой инфекции. Наука. 2014; 345: 570–3.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

53.

Ли Б., Глэдден А.Д., Альтфельд М., Калдор Дж. М., Купер Д.А., Келлехер А.Д., Аллен Т.М. Быстрая реверсия полиморфизмов последовательностей доминирует в ранней эволюции вируса иммунодефицита человека типа 1. J Virol. 2007. 81: 193–201.

CAS Статья PubMed Google Scholar

54.

Ласки С.Б., Полмайер К.В., Брунер К.М., Силичиано РФ. Оценка клональной экспансии ВИЧ-инфицированных клеток: оптимизация стратегий ПЦР для прогнозирования клональности. PLoS Pathog.2016; 12: e1005689.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

55.

Генрих Т.Дж., Ханхаузер Э., Марти Ф.М., Сириньяно Миннесота, Китинг С., Ли Т.Х., Роблес Ю.П., Дэвис Б.Т., Ли Дж.З., Хейси А. и др. Ремиссия ВИЧ-1 без антиретровирусной терапии и возврат вируса после трансплантации аллогенных стволовых клеток: отчет о 2 случаях. Ann Intern Med. 2014; 161: 319–27.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

56.

Генрих Т.Дж., Ху З., Ли Дж.З., Скиарангелла Дж., Буш М.П., ​​Китинг С.М., Галлиен С., Лин Н.Х., Гигель Ф.Ф., Лавуа Л. и др. Долгосрочное сокращение резервуаров ВИЧ 1 типа в периферической крови после кондиционирующей аллогенной трансплантации стволовых клеток с пониженной интенсивностью. J Infect Dis. 2013; 207: 1694–702.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

57.

Cummins NW, Rizza S, Litzow MR, Hua S, Lee GQ, Einkauf K, Chun TW, Rhame F, Baker JV, Busch MP и др.Обширная вирусологическая и иммунологическая характеристика ВИЧ-инфицированного человека после аллогенной трансплантации стволовых клеток и аналитического прекращения антиретровирусной терапии: тематическое исследование. PLoS Med. 2017; 14: e1002461.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

58.

Хенрих Т.Дж., Хатано Х., Бэкон О., Хоган Л.Э., Рутисхаузер Р., Хилл А., Кирни М.Ф., Андерсон Е.М., Бухбиндер С.П., Коэн С.Е. и др. Персистентность ВИЧ-1 после чрезвычайно раннего начала антиретровирусной терапии (АРТ) во время острой инфекции ВИЧ-1: обсервационное исследование.PLoS Med. 2017; 14: e1002417.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

59.

Hill AL, Rosenbloom DI, Fu F, Nowak MA, Siliciano RF. Прогнозирование результатов лечения для ликвидации латентного резервуара ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111: 13475–80.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

60.

Hill AL, Rosenbloom DI, Goldstein E, Hanhauser E, Kuritzkes DR, Siliciano RF, Henrich TJ.Прогнозы размера резервуара и времени восстановления в реальном времени во время испытаний по прерыванию антиретровирусной терапии ВИЧ. PLoS Pathog. 2016; 12: e1005535.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

Возможная роль в скрытой динамике коллектора

J Exp Med. 2017 г. 3 апреля; 214 (4): 959–972.

Артикул

, ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ¹ , ² , ³ , ¹ , ¹ и ^{1, 4 1, 4}

Нина Н.Хосман

¹ Кафедра медицины Медицинского факультета Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Кюнъюн Дж. Квон

¹ Кафедра медицины Медицинской школы Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Кэтрин M. Bruner

¹ Медицинский факультет Медицинской школы Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Адам А. Капоферри

¹ Медицинский факультет Медицинской школы Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Subul Beg

¹ Медицинский факультет Медицинского факультета Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Daniel I.С. Розенблум

² Департамент биомедицинской информатики, Медицинский центр Колумбийского университета, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10032

Брэндон Ф. Кил

³ Программа по вирусам СПИДа и рака, Leidos Biomedical Research Inc., Национальная лаборатория им. Фредерика. Cancer Research, Frederick, MD 21702

Ya-Chi Ho

¹ Медицинский факультет Медицинского факультета Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

Джанет Д. Силичиано

¹ Медицинский факультет Джона Хопкинса Медицинский факультет Университета, Балтимор, Мэриленд 21205

Роберт Ф.Siliciano

¹ Медицинский факультет Медицинского факультета Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, Балтимор, Мэриленд 21205

¹ Медицинский факультет Медицинского факультета Университета Джонса Хопкинса , Балтимор, Мэриленд, 21205

² Департамент биомедицинской информатики, Медицинский центр Колумбийского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк 10032

³ Программа по вирусам СПИДа и рака, Leidos Biomedical Research Inc., Национальная лаборатория исследований рака имени Фредерика, Фредерик, Мэриленд, 21702

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, Балтимор, Мэриленд 21205

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 29.01.2017 г .; Пересмотрено 14 февраля 2017 г .; Принято 15 февраля 2017 г.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Скрытый резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 ⁺ Т-лимфоцитах препятствует излечению. Механизмы, лежащие в основе устойчивости коллектора, неясны. Недавние исследования предполагают неожиданную степень пролиферации инфицированных клеток in vivo.Активация Т-клеток стимулирует пролиферацию, но также меняет латентный период, что приводит к продуктивной инфекции, которая обычно приводит к гибели клеток. В этом исследовании мы показываем, что латентно инфицированные клетки могут размножаться в ответ на митогены, не производя вируса, генерируя клетки-потомки, которые могут выделять инфекционный вирус. Таким образом, анализы, основанные на одном раунде активации, недооценивают размер резервуара. Секвенирование независимых клональных изолятов репликационно-компетентного вируса показало, что 57% имели последовательности env , идентичные другим изолятам от того же пациента.Идентичность была подтверждена полногеномным секвенированием и не объяснялась ограниченным вирусным разнообразием. Филогенетический и статистический анализ показал, что идентичные последовательности возникли в результате пролиферации инфицированных клеток in vivo, а не заражения множества клеток доминирующим видом вируса. Возможность того, что большая часть резервуара возникает в результате пролиферации клеток, требует лечения.

Введение

Стабильный латентный резервуар ВИЧ-1 в памяти покоя CD4 ⁺ Т-клетки сохраняется, несмотря на антиретровирусную терапию (АРТ; Chun et al., 1995, 1997а, б; Finzi et al., 1997, 1999; Wong et al., 1997; Силичиано и др., 2003; Strain et al., 2003; Crooks et al., 2015). Чрезвычайно длительный период полураспада этого резервуара является основным препятствием для лечения (Finzi et al., 1999; Siliciano et al., 2003; Strain et al., 2003; Crooks et al., 2015). Этот резервуар латентного, но способного к репликации ВИЧ-1 был первоначально идентифицирован в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках в крови и лимфатических узлах (Chun et al., 1995, 1997a), но известные паттерны циркуляции, активации и дифференцировки Т-клетки памяти предсказывают, что стойкий ВИЧ-1 будет находиться во множестве подмножеств клеток памяти во множестве тканей (Chomont et al., 2009; Buzon et al., 2014; Сориано-Сарабия и др., 2014; Banga et al., 2016; Boritz et al., 2016). Скрытый резервуар является основной целью усилий по лечению, некоторые из которых сосредоточены на обращении латентного периода, чтобы инфицированные клетки могли быть устранены с помощью иммунных механизмов (Richman et al., 2009; Archin et al., 2012; Halper-Stromberg et al., 2014; Дикс и др., 2016).

Одно из возможных объяснений удивительной стабильности латентного резервуара связано с пролиферацией инфицированных клеток (Tobin et al., 2005; Бейли и др., 2006; Chomont et al., 2009; Bosque et al., 2011; Мальдарелли и др., 2014; Wagner et al., 2014; Lorenzi et al., 2016; Simonetti et al., 2016). Разрастание инфицированных клеток до некоторой степени неожиданно. Некоторые стимулы, которые управляют пролиферацией Т-клеток, также переводят латентно инфицированные клетки в продуктивно инфицированное состояние, а продуктивно инфицированные клетки имеют очень короткий период полужизни (1 день; Ho et al., 1995; Wei et al., 1995). Кроме того, белок Vpr ВИЧ-1 вызывает остановку клеточного цикла (Jowett et al., 1995; Стюарт и др., 1997, 2000; Сакаи и др., 2006; ДеХарт и др., 2007; Hrecka et al., 2007; Schröfelbauer et al., 2007; Романи и Коэн, 2012). В некоторых модельных системах цитокины, включая IL-7 и IL-15, могут управлять гомеостатической пролиферацией Т-клеток CD4 ⁺ , не индуцируя экспрессию вирусных генов (Bosque et al., 2011; Vandergeeten et al., 2013). Однако IL-7 может также изменять латентность в некоторых системах (Scripture-Adams et al., 2002; Wang et al., 2005).

Несмотря на эти проблемы, существует множество доказательств того, что инфицированные клетки могут размножаться in vivo.Доказательства бывают двух видов. У пациентов, которые начинают АРТ во время хронической инфекции, обширная диверсификация вирусных последовательностей, которая имеет место до лечения (Shankarappa et al., 1999; Brodin et al., 2016), делает маловероятным, что несколько независимо взятых вирусных последовательностей от одного пациента будут идентичными. . Следовательно, повторное выделение идентичных вирусных последовательностей от отдельных пациентов можно наиболее легко объяснить, если предположить, что первоначально инфицированная клетка, несущая последовательность, впоследствии пролиферировала, без ошибок копируя интегрированный вирусный геном в клетки-потомки.Секвенирование следовых уровней вируса в плазме крови у пролеченных пациентов первоначально дало неожиданный результат: в этой остаточной виремии часто преобладала одна, часто выделяемая последовательность (Tobin et al., 2005; Bailey et al., 2006). Последующие исследования провирусной ДНК также выявили независимые идентичные последовательности (Bailey et al., 2006; von Stockenstrom et al., 2015; Bruner et al., 2016; Lorenzi et al., 2016). Хотя эти исследования убедительно свидетельствуют о пролиферации инфицированных клеток in vivo, есть предостережения.Изоляты, идентичные в секвенированной части генома, могут отличаться в другом месте и могут не быть клональными (Laskey et al., 2016) или могут представлять отдельные события заражения идентичным вирусом. Кроме того, подавляющее большинство провирусов являются дефектными (Ho et al., 2013; Bruner et al., 2016; Imamichi et al., 2016) и не имеют полногеномного секвенирования (Ho et al., 2013) или анализов вирусного роста. (VOAs; Lorenzi et al., 2016), остается неясным, представляют ли идентичные последовательности репликационно-компетентный вирус.Важное недавнее исследование Lorenzi et al. изучил большое количество независимых изолятов репликационно-компетентного вируса от пациентов, получавших лечение, и обнаружил, что> 50% идентичны последовательностям в гене env с другими изолятами от тех же пациентов (Lorenzi et al., 2016).

Окончательные доказательства пролиферации инфицированных клеток были получены с помощью другого экспериментального подхода — анализа сайтов интеграции ВИЧ-1. Недавние исследования показали, что у данного пациента удивительно большая фракция инфицированных CD4 ⁺ Т-клеток демонстрирует интеграцию провирусов в точно такое же положение в геноме человека (Maldarelli et al., 2014; Wagner et al., 2014; Cohn et al., 2015). Учитывая относительно неспецифическую интеграцию ВИЧ-1 в экспрессируемые гены по всему геному (Schröder et al., 2002; Han et al., 2004), этот результат можно объяснить только пролиферацией инфицированных клеток после интеграции. Интересно, что некоторые из увеличенных клонов продемонстрировали интеграцию в клеточные гены, связанные с выживанием и / или пролиферацией клеток, что повышает вероятность того, что измененная экспрессия гена-хозяина может управлять пролиферацией (Maldarelli et al., 2014; Wagner et al., 2014). Однако анализ сайта интеграции захватывает только концы вирусного генома, и вполне вероятно, что большинство расширенных клеточных клонов, обнаруженных с помощью анализа сайта интеграции, являются дефектными по репликации, как было показано Cohn et al. (2015). К сожалению, с помощью современных методов трудно одновременно и эффективно получить как сайт интеграции, так и полную провирусную последовательность. Интересно, что недавнее исследование Simonetti et al. (2016) описали сильно увеличившийся клон Т-лимфоцитов CD4 ⁺ , несущий репликационно-компетентный вирус, у пациента со сложным течением заболевания.

В совокупности эти результаты поднимают интересную возможность того, что пролиферация инфицированных клеток может вносить вклад в стабильность латентного резервуара. Чтобы изучить эту проблему, мы выполнили стимуляцию ex vivo и анализ одного генома, чтобы найти доказательства клональной экспансии у инфицированных лиц, получающих АРТ.

Результаты

Анализ пролиферации инфицированных клеток с использованием множественной стимуляции VOA (MS-VOA)

Учитывая, что продуктивно инфицированные клетки имеют короткий период полужизни in vivo (1 день; Ho et al., 1995; Wei et al., 1995), мы предположили, что пролиферация латентно инфицированных клеток, несущих репликационно-компетентный ВИЧ-1, может происходить без высвобождения инфекционного вируса. Чтобы проверить эту гипотезу, мы подвергли покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки пациентов, получающих долгосрочную АРТ, многократным раундам стимуляции митогена, чтобы обнаружить высвобождение вируса из клеток, которые пролиферировали в ответ на предыдущую стимуляцию без образования инфекционного вируса. Этот анализ, модифицированный по сравнению со стандартным количественным VOA (QVOA; Chun et al., 1997a; Finzi et al., 1997, 1999; Силичиано и др., 2003; Силичиано и Силичиано, 2005; Laird et al., 2013, 2016), используемый для измерения латентно инфицированных клеток, описан в. Предельные разведения очищенных покоящихся Т-клеток CD4 ⁺ были максимально стимулированы мощным митогеном Т-клеток ФГА и облученными аллогенными РВМС от нормальных доноров. Клетки MOLT4, трансфицированные CCR5 (MOLT4 / CCR5; Laird et al., 2013), были добавлены для увеличения количества вируса, высвобождаемого из клеток, в которых латентность была обращена. Клетки пациентов и клетки MOLT4 / CCR5 высевали в отдельные камеры планшетов с транслуночками.Это позволяет раздельно манипулировать клетками пациента, также обеспечивая активацию Т-клеток и рост вируса, эквивалентные стандартным совместным культурам (Ho et al., 2013). Через 8 дней половину содержимого каждой лунки переносили в соответствующие камеры новых планшетов, которые получали дополнительную стимуляцию. Исходные чашки культивировали без дополнительной стимуляции в течение 21 дня (). Таким образом было выполнено в общей сложности четыре последовательных стимуляции. Каждую лунку культивировали в течение 21 дня после последней стимуляции, достаточного времени, чтобы позволить вирусу, высвобожденному из одной клетки, экспоненциально расти в клетках MOLT4 / CCR5 до уровней, легко определяемых с помощью ELISA p24 (Laird et al., 2013). Затем вирусную РНК в супернатантах лунок p24 ⁺ подвергали анализу последовательности. Этот протокол позволяет оценить, могут ли клетки, которые ранее пролиферировали в ответ на активацию Т-клеток без продуцирования инфекционного вируса, выделять вирус при дополнительной стимуляции ().

MS-VOA. (a) Система совместного культивирования через лунки (Ho et al., 2013) была использована, чтобы позволить раздельное манипулирование Т-клетками CD4 ⁺ пациента (зеленый) и клетками MOLT4 / CCR5 (красный).Очищенные покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки от субъектов, получающих АРТ, высевали в предельном разведении для вирусного разрастания и стимулировали ФГА и облученными аллогенными РВМС (не изображены), как описано ранее (Finzi et al., 1997, 1999; Siliciano et al. , 2003; Laird et al., 2016). Через 24 часа PHA удаляли и добавляли 10 ⁶ клеток MOTL4 / CCR5. Разрастание в этой системе эквивалентно стандартным совместным культурам (Ho et al., 2013). (b) Продолжительность анализа. Через 8 дней после начальной стимуляции PHA половину объема из верхней и нижней камер каждой трансвеллеров переносили на новый набор планшетов трансвелл для второго раунда стимуляции PHA.Исходные чашки культивировали без дополнительной стимуляции в течение всего 21 дня. Рестимулированные чашки культивировали в течение 8 дней после второго раунда стимуляции PHA, а затем разделяли, как указано выше, для создания третьего набора чашек, которые получали третий раунд стимуляции. Точно так же эти пластины были разделены 8 дней спустя, чтобы получить четвертый набор пластин, который получил четвертый раунд стимуляции. ELISA на p24 выполняли через 21 день после каждого соответствующего раунда стимуляции PHA для количественной оценки вирусного роста (пунктирные линии).В этом гипотетическом примере каждый цикл стимуляции PHA вызывал рост из дополнительной лунки (черные кружки). (c) стимуляция PHA индуцирует равномерную пролиферацию покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток. Непосредственно перед первой стимуляцией PHA аликвоту покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток окрашивали CFSE. Разведение CFSE определяли количественно с помощью проточной цитометрии через 7 дней после стимуляции для определения доли пролиферировавших клеток (красная гистограмма). Клетки, которые не получали стимуляции PHA, служили контролем (синие гистограммы).Гистограмма представляет собой разведение CFSE от трех субъектов. (d) Увеличение количества клеток после каждого раунда стимуляции. Показаны результаты для трех репрезентативных субъектов. (e) Экспрессия маркера активации, индуцированная каждым раундом стимуляции PHA. Клетки окрашивали антителами к CD4 (ось x) и маркерами активации CD25, CD69 и HLA-DR (ось y) через 7 дней после указанного цикла стимуляции PHA (красные точки). Клетки, не получившие последнего раунда стимуляции PHA, анализировали параллельно (синие точки).Результаты показаны для субъекта 10 и являются репрезентативными для двух других проанализированных субъектов.

Первоначальная стимуляция вызвала пролиферацию> 99% пациентов CD4 ⁺ Т-клеток в состоянии покоя (). Количество клеток увеличилось в восемь раз в течение первой недели, с меньшим увеличением после второй, третьей и четвертой стимуляции (3,5-, 2,5- и двукратное, соответственно;). Первоначальная стимуляция также заставляла> 99% клеток экспрессировать маркеры активации Т-клеток (). Хотя клетки не возвращались в полностью покоящееся состояние перед второй, третьей и четвертой стимуляциями, каждая стимуляция увеличивала экспрессию маркера активации по сравнению с клетками, которые не получали самую последнюю стимуляцию ().

Этот MS-VOA был выполнен на очищенных покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках от 12 участников (01–12) на длительной супрессивной АРТ (характеристики пациентов см. В таблице S1). Средняя частота латентно инфицированных клеток, обнаруженная после первой стимуляции, составила 0,83 инфекционных единицы на миллион покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток, что незначительно отличается от данных, наблюдаемых в исследованиях с использованием стандартного QVOA (Finzi et al., 1999; Siliciano et al. , 2003; Eriksson et al., 2013). Однако для каждого субъекта дополнительные раунды стимуляции вызывали рост вируса в культурах, выделенных из лунок, которые оставались отрицательными для роста вируса без дополнительной стимуляции ().Поскольку все клетки пролиферируют в ответ на PHA (), этот результат указывает на то, что некоторые латентно инфицированные клетки пролиферировали без высвобождения инфекционного вируса, но сохранили способность делать это после последующей стимуляции. Эти результаты согласуются с предыдущей работой, показывающей, что один раунд стимуляции в стандартном QVOA не обнаруживает весь присутствующий латентный вирус (Ho et al., 2013), и с исследованием на первичной клеточной модели, показывающим, что цитокиновая гомеостатическая пролиферация латентно инфицированных клеток может происходить без повышения экспрессии гена ВИЧ-1 (Bosque et al., 2011).

Дальнейшие раунды активации Т-клеток индуцируют дополнительные провирусы, чтобы продуцировать компетентный к репликации вирус. (a) Фракция изначально засеянных лунок, становящаяся p24 ⁺ после каждой из четырех последовательных стимуляций с помощью ФГА. Для каждого субъекта ( n = 12) первоначально было засеяно 64–72 лунки. Звездочка указывает, что клетки от субъекта 1 получили только три цикла стимуляции PHA. (b) Фракция всего p24 ⁺ лунок от каждого субъекта ( n = 12), которые были обнаружены для каждого раунда стимуляции PHA.Знаменатель — это общее количество изначально засеянных скважин. (c) Частота клеток в культуре во время стимуляции, которые индуцируются для продуцирования репликационно-компетентного вируса указанным циклом стимуляции. Частота в инфекционных единицах на миллион (IUPM) клеток была определена для каждого субъекта ( n = 12) из ​​среднего количества клеток перед каждой стимуляцией и количества лунок, повернувшихся на p24 ⁺ после стимуляции, с использованием оценки максимальной вероятности частоты инфицированных клеток. (Розенблум и др., 2015). (d) Экспрессия TIM-3 до стимуляции (черная линия) и через 7 дней после указанного цикла стимуляции. Результаты представляют анализ маркеров истощения у трех субъектов. (e) Частота латентно инфицированных клеток среди первоначально высеянных клеток от каждого субъекта ( n = 12), обнаруженная после одного раунда стимуляции PHA и всего после четырех последовательных раундов стимуляции. (f) Схематическое изображение относительной частоты инфицированных покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток, обнаруженных с помощью различных анализов.Результат VOA представляет собой среднюю частоту, обнаруженную после одного раунда стимуляции PHA в культурах от 12 исследуемых здесь субъектов. Результат MS-VOA представляет собой среднюю частоту латентно инфицированных клеток среди первоначально высеянных клеток, определенную всего за четыре последовательных цикла стимуляции PHA. Частоты клеток с интактными (не дефектными) провирусами и общую частоту инфицированных клеток, измеренную с помощью ПЦР с праймерами gag , оценивали на основе результатов VOA и соотношений, описанных Bruner et al.(2016). Истинная частота латентно инфицированных клеток находится между частотой, измеренной в MS-VOA, и частотой клеток с интактными провирусами.

Эти исследования позволили понять взаимосвязь между активацией Т-клеток, пролиферацией и обращением латентного периода. Расщепляя культуры пролиферирующих Т-клеток CD4 ⁺ , можно определить, может ли дополнительная стимуляция вызывать продукцию вируса, когда другие клетки из той же клональной популяции не могут продуцировать вирус после начальной стимуляции.Из всех культур, которые в конечном итоге становятся положительными на рост, только в среднем 60% были обнаружены после первой стимуляции (). У 11 из 12 пациентов двух раундов стимуляции было недостаточно для индукции всех провирусов, которые в конечном итоге были индуцированы в третьем или четвертом раунде (). Эти результаты демонстрируют сложность очистки латентного резервуара даже при максимальной активации Т-клеток. Вероятно, потребуется несколько раундов максимальной стимуляции. Однако у 4 из 12 участников 70–80% изолятов были получены в первом раунде стимуляции.Интересно, что поскольку количество клеток увеличивалось с каждой стимуляцией (), вероятность роста каждой клетки падала после первой стимуляции (). Это может отражать различия в индуцируемости провирусов: легко индуцируемая популяция и обычно меньшая популяция, которую труднее вызвать. Альтернативно, изменения в транскрипционной среде с повторяющейся стимуляцией во время длительного культивирования in vitro могут предотвратить индукцию некоторых интактных провирусов, которые могут быть индуцированы in vivo.Чтобы рассмотреть эту возможность, мы исследовали экспрессию CD4 ⁺ Т-клетками поверхностных белков, связанных с функциональным ингибированием или иммунным истощением (Anderson et al., 2016), включая PD-1, CTLA-4 и Tim-3. Мы наблюдали повышенную экспрессию Tim-3 после многократных стимуляций (). Истощение клеток в культуре может способствовать последовательному снижению вероятности разрастания. Таким образом, MS-VOA обеспечивает только минимальную оценку латентного размера резервуара, поскольку иммунное истощение, развивающееся при повторяющейся стимуляции и / или длительной культуре in vitro, может не допускать роста всех потенциально индуцируемых репликационно-компетентных провирусов.Частота латентно инфицированных клеток, обнаруженная с помощью MS-VOA, была примерно в два раза выше, чем стандартное значение QVOA, измеренное после одного раунда стимуляции (). Фактическая частота латентно инфицированных клеток, вероятно, находится между измерением MS-VOA и общим количеством интактных (исправных) провирусов (). Вместе эти результаты демонстрируют, что латентно инфицированные клетки, несущие репликационно-компетентный ВИЧ-1, могут пролиферировать в ответ на стимуляцию ex vivo без образования инфекционного вируса, хотя и сохраняют способность делать это впоследствии.

Независимое выделение идентичных последовательностей репликационно-компетентного вируса из латентного резервуара

Способность латентно инфицированных клеток пролиферировать ex vivo без высвобождения вируса предполагает, что клональная экспансия in vivo инфицированных клеток может поддерживать латентный резервуар. Если увеличенные клеточные клоны составляют значительную часть латентного резервуара, должна быть возможность получить от отдельных пациентов независимые изоляты репликационно-компетентного вируса с идентичной последовательностью во всем вирусном геноме.Мы смогли напрямую проверить это предсказание уникальным способом благодаря большому количеству независимых изолятов репликационно-компетентного ВИЧ-1, полученных при предельном разведении после различных раундов стимуляции в MS-VOA. Во-первых, мы амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР высоко вариабельную область V3-V4 гена env из вирусной РНК в супернатантах всех лунок p24 ⁺ из MS-VOA от всех 12 испытуемых. Поскольку клетки первоначально высевали в предельном разведении для роста вируса, большинство положительных лунок содержали только одну последовательность, а лунки с множественными последовательностями отбрасывали.Последовательности от каждого субъекта сгруппированы вместе и отдельно от других субъектов в филогенетическом анализе (рис. S1). Хотя все участники начали АРТ во время хронической инфекции (таблица S1), у 9 из 12 субъектов был один или несколько наборов независимых изолятов с идентичной последовательностью в сильно изменчивой области V3-V4 гена env (). Наборы изолятов с идентичными последовательностями env наблюдались у девяти из девяти пациентов, от которых было получено более 10 изолятов, что убедительно свидетельствует о том, что это явление является общим.Важно отметить, что изоляты с идентичными последовательностями env не являются результатом пролиферации in vitro; все эти изоляты происходили из разных лунок исходных планшетов для тканевых культур (), что указывает на то, что они получены из разных инфицированных клеток, присутствующих in vivo. Из 197 независимых изолятов от 12 субъектов 113 (57%) принадлежали к наборам изолятов с идентичными последовательностями env , тогда как оставшиеся 43% имели уникальные последовательности env ().

Многие независимые изоляты репликационно-компетентного ВИЧ-1 имеют идентичные последовательности. Филогенетические деревья последовательностей env независимых изолятов репликационно-компетентного вируса от каждого субъекта ( n = 12). Секвенирование проводили на геномной вирусной РНК в супернатантах лунок p24 ⁺ . Культуры были созданы при предельном разведении для вирусного роста. Изоляты, содержащие более одной последовательности, на что указывают двойные пики в одном или нескольких положениях на хроматограммах, в дальнейшем не анализировались. Символы указывают количество стимуляций ФГА, после которых был получен изолят.Наборы изолятов с идентичными последовательностями env заключены в рамки. Репрезентативные изоляты, полученные после разного количества стимуляций (стрелки) из случайно выбранных наборов, были подвергнуты полноразмерному секвенированию на уровне одного генома (см.).

Изоляты с идентичными последовательностями

env идентичны по всему геному ВИЧ-1

Эти результаты согласуются с идеей о том, что большинство латентно инфицированных клеток возникает в результате пролиферации меньшего числа ранее инфицированных клеток.Однако альтернативные объяснения следует исключить. Во-первых, возможно, что изоляты с идентичными последовательностями env отличаются в другом месте генома (Laskey et al., 2016). Чтобы обратиться к этой возможности, мы сначала определили оценку клонального предсказания, меру способности субгеномных ампликонов предсказывать клональность (Laskey et al., 2016). Для этого ампликона env оценка клонального предсказания составила 96, что означает, что 96% временных последовательностей, идентичных в этой области, идентичны во всем вирусном геноме на основе доступных полногеномных последовательностей от VOA.Чтобы предоставить прямые экспериментальные доказательства того, что изоляты с идентичными последовательностями env были идентичны по всему геному ВИЧ-1, мы использовали одногеномный анализ геномной вирусной РНК в супернатантах лунок p24 ⁺ для получения полногеномных последовательностей репрезентативные изоляты, принадлежащие к наборам изолятов с идентичными последовательностями env . Секвенирование проводилось на двух перекрывающихся фрагментах половинного генома. Нам удалось получить полногеномные последовательности из полугеномных последовательностей, потому что перекрывающиеся области были идентичны и, что более важно, потому что только один провирус давал рост в этих культурах с ограниченным разведением.Хотя в этих культурах могли присутствовать дефектные провирусы, глубокая природа обычно наблюдаемых дефектов (Ho et al., 2013; Bruner et al., 2016; Imamichi et al., 2016) препятствовала бы высвобождению вириона в супернатант. Для каждого тестируемого изолята было получено 6–12 последовательностей одного генома при предельном разведении РНК в супернатанте. Чтобы избежать ошибок ПЦР, продукты ПЦР секвенировали напрямую, без клонирования (Hatziioannou et al., 2014). Последовательности для каждого изолята были идентичными или очень похожими (), с разницей от одного до четырех нуклеотидов, вероятно, представляющих ожидаемую вариацию (Mansky and Temin, 1995), возникающую в течение 3-недельного периода культивирования, используемого для получения каждого изолята ().Важно отметить, что одногеномные последовательности из разных изолятов, принадлежащих к данному набору с идентичными последовательностями env , были смешаны в филогенетическом анализе (). Генетические расстояния между последовательностями из одного и того же изолята и из других изолятов, принадлежащих к одному и тому же набору, существенно не различались и были намного меньше, чем генетическое расстояние между последовательностями из данного набора и других изолятов от того же субъекта (). Консенсусные полугеномные последовательности для каждого изолята использовали для построения полногеномных последовательностей.Филогенетический анализ полногеномных последовательностей снова показал, что изоляты с идентичными последовательностями env сгруппированы вместе в монофилетический паттерн (). Вместе эти результаты демонстрируют, что изоляты с идентичными последовательностями env идентичны по всему геному.

Полногеномный анализ изолятов с идентичными последовательностями env . (a) Полногеномные последовательности изолятов с идентичными последовательностями env . Произвольно выбранные изоляты (стрелки в), принадлежащие к наборам изолятов с идентичной последовательностью env , подвергали полноразмерному секвенированию.Секвенирование выполняли на отдельных молекулах геномной РНК ВИЧ-1, присутствующих в супернатантах культур p24 ⁺ после обратной транскрипции и вложенной ПЦР-амплификации, выполняемой при предельном разведении. Были амплифицированы два перекрывающихся фрагмента половинного генома. Чтобы минимизировать ошибки, продукты ПЦР секвенировали напрямую без клонирования. Для каждого изолята было получено 6-12 ограничивающих 5′-последовательностей и 6-12 3′-последовательностей. Объединение соседних филогенетических деревьев продемонстрировало, что все последовательности из данного набора изолятов с идентичными последовательностями env объединяются в кластеры.Минимальные различия (от одного до четырех нуклеотидов), вероятно, отражают мутации, которые, как ожидается, возникнут во время 3-недельной культуры выростов. Символы указывают на стимуляцию PHA, после которой были обнаружены изоляты, как в. Результаты показаны для 5′-полугеномных последовательностей. Аналогичные результаты были получены для последовательностей 3′-половинного генома. (b) Генетическое расстояние (среднее ± стандартное отклонение) между последовательностями одного генома из одного изолята (внутри изолята), между последовательностями одного генома из разных изолятов, принадлежащих к набору изолятов с идентичными последовательностями env (внутри набора) , между последовательностями одного генома из разных наборов от одного и того же объекта исследования (внутри субъекта) и между последовательностями одного генома от разных пациентов.Для каждого набора из двух-трех изолятов от данного субъекта использовали 6–12 последовательностей для сравнений внутри изолята и внутри набора. Затем все последовательности использовались для сравнений внутри субъектов и между субъектами. (c) Филогенетическое дерево полногеномных консенсусных последовательностей. 6–12 одиночных полугеномных последовательностей от каждого изолята были конденсированы в полугеномные консенсусные последовательности, которые были объединены для получения полногеномных последовательностей. Набор 2 от субъекта 2 не изображен из-за сбоя реакции 3′-полугенома в результате несоответствия праймеров.

Доминирующая вирусная последовательность в сравнении с клональной экспансией

Есть два объяснения наличия у инфицированных людей множества инфицированных клеток с идентичной вирусной последовательностью. Либо все клетки были инфицированы преобладающей однородной популяцией вируса без мутаций, либо одна клетка, несущая конкретную вирусную последовательность, интенсивно пролиферировала после заражения, копируя вирусный геном без ошибок в дочерние клетки. Первое объяснение может применяться во время острой инфекции до того, как произойдет диверсификация.Однако участники этого исследования начали АРТ во время хронической инфекции (таблица S1), и, таким образом, ожидается, что они будут иметь большое разнообразие вирусных последовательностей (Shankarappa et al., 1999; Maldarelli et al., 2013; Brodin et al., 2016). Чтобы продемонстрировать это разнообразие, мы использовали одногеномную амплификацию ДНК из некультивируемых покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток для получения последовательностей генов env провирусов от тех же пациентов. Эти последовательности были отображены на филогенетических деревьях вместе с последовательностями env из компетентных к репликации изолятов, описанных выше.Этот анализ показал, что изоляты, способные к репликации, были частью гораздо более сложных популяций провирусов у каждого субъекта (). Многие из этих провирусов могут иметь дефекты в другом месте генома и, таким образом, не обязательно будут демонстрировать тесную филогенетическую связь с репликационно-компетентными изолятами. Вместе эти результаты показывают, что выделение нескольких независимых клонов репликационно-компетентного вируса с идентичной последовательностью не вызвано отсутствием разнообразия последовательностей у этих индивидуумов.

Изоляты с идентичной последовательностью являются частью более сложных провирусных популяций, что отражает диверсификацию с течением времени при хронической инфекции. Анализ предельного разведения провирусов, присутствующих в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках, выполняли на клетках трех репрезентативных пациентов, от которых были получены наборы идентичных изолятов репликационно-компетентного вируса. Область V3-V4 env секвенировали, и полученные последовательности (светлые кружки) использовали в филогенетическом анализе вместе с репликационно-компетентными изолятами (закрытый символ; формы отражают количество стимуляции PHA, как показано на рисунке).Наборы идентичных независимых последовательностей помещены в рамку.

Чтобы изучить возможность того, что изоляты с идентичной последовательностью возникли в результате заражения многих клеток доминирующей популяцией вируса, мы сначала исследовали генетическое расстояние между изолятами от одного и того же субъекта (). Это было сделано с использованием последовательностей env , полученных из вирусной РНК в супернатантах всех лунок клонального p24 ⁺ из MS-VOA (). Если у данного субъекта значительная часть латентного резервуара образуется в результате инфицирования многих клеток доминантным вирусным видом, также должны присутствовать последовательности, близкие к доминантному виду.Основываясь на частоте ошибок обратной транскрипции (Mansky, Temin, 1995; Abram et al., 2010), можно ожидать, что единственная замена основания ожидается в 15–30% клеток, инфицированных этим доминирующим видом вируса. Другие близкородственные последовательности должны генерироваться по мере распространения этой инфекции, что приводит к образованию многих последовательностей, близких к доминантной последовательности. Поэтому мы исследовали распределение генетических дистанций между независимыми изолятами, чтобы определить, присутствовали ли изоляты, близкие по последовательности к доминирующим вирусным видам.Как проиллюстрировано в, наблюдаемое распределение генетических расстояний внутри субъекта не поддерживает эту гипотезу инфицирования многих клеток доминирующим вирусным видом. На самом деле существует поразительное количество вариантов, близких по последовательности к наборам идентичных последовательностей.

Распределение генетических дистанций между изолятами репликационно-компетентного вируса от отдельных субъектов ( n = 12) не подтверждает инфицирование большого количества клеток доминирующей вирусной популяцией. Составная гистограмма, показывающая распределение генетических расстояний внутри субъекта между изолятами репликационно-компетентного вируса. Чтобы учесть различную степень генетической дивергенции во времени у разных субъектов, расстояния нормируются на наибольшее наблюдаемое расстояние внутри субъекта. Анализ основан на сильно вариабельном участке V3-V4 гена env , полученном, как описано в. Большой пик в начале координат отражает нулевую длину ветвей между независимыми идентичными изолятами репликационно-компетентного вируса, полученными от 9 из 12 пациентов.

Для дальнейшего изучения возможности того, что высокая доля независимых изолятов с идентичной последовательностью является результатом заражения многих клеток доминирующим вирусным видом, мы сосредоточили внимание на пяти субъектах (S01, S03, S10, S11 и S12), для которых были единый большой набор идентичных изолятов, филогенетически отделенный от других изолятов или наборов изолятов от того же субъекта. Мы разработали статистический анализ, основанный на теории слияния, чтобы изучить возможность того, что наблюдаемая высокая степень идентичности последовательностей может быть объяснена просто раундами вирусной репликации, в которых не произошло никаких мутаций.выбран, чтобы максимизировать вероятность наблюдения конфигурации в соответствии с формулой выборки Ювенса для слитка (Ewens, 1972). Этот расчет обеспечивает вероятность вложенной модели для статистического теста (т.е. вероятность без клональной пролиферации). Предполагается, что клональная пролиферация изменяет конфигурацию набора изолятов путем взятия одной последовательности и увеличения ее множественности с помощью механизма, который иначе не присутствует в стандартной модели слияния. Чтобы смоделировать такое поведение, мы предполагаем, что пролиферирующая последовательность является (одной из) наиболее часто наблюдаемой последовательностью и что она эффективно заменяет несколько одноэлементных последовательностей, которые в противном случае наблюдались бы в образце.и логарифмическая вероятность вычисляются для этой измененной конфигурации. Затем значение p получается с помощью теста отношения правдоподобия с одной степенью свободы (). Паттерны у всех пяти из этих субъектов значительно нарушают распределение наборов изолятов, ожидаемое при стандартной эволюционной динамике без пролиферации (P = 0,0003–0,027). Для всех пяти проанализированных участников низкие значения p указывают на то, что репликация вируса без мутаций не является недостаточным объяснением данных.

Таблица 1.

^f LL ^г 01 1: 3 1,67 −3,75 1:12 100 −0,63 6,23 0,013 9: 1 03 1: 8 10.81 −6,51 1:14 27,38 −4,06 4,91 0,027 2: 3 2: 4 3: 3 3: 3 10 1: 8 11.74 −4,70 1:14 50,68 −1,85 5,71 0,017 2: 3 909 909 900 6: 1 1196 −7,57 1:17 100 −1,08 12,98 0,0003 8: 1 1 12 1: 5 6,69 −3,01 1: 9 100 −0,3533 0,021 4: 1

Схематическое изображение теста на основе статистической теории коалесценции исследовать возможность того, что наблюдаемая высокая степень идентичности последовательностей может быть объяснена просто раундами вирусной репликации, в которых мутации не произошло. Левая часть рисунка представляет образец от участника 03, проанализированный путем секвенирования гена env в супернатанте РНК ВИЧ-1 из лунок клонального p24 ⁺ (см.).Всего был получен 31 независимый изолят, включая один набор из восьми изолятов (темно-синие клетки), шесть меньших наборов (другие цвета) и восемь уникальных изолятов (синглтоны). Правая сторона представляет собой образец того же размера, который был бы собран, если бы не произошло клональной пролиферации. Большой клон уменьшается до размера, который максимизирует вероятность при нейтральном слиянии, и добавляются синглтоны, чтобы общая выборка оставалась того же размера. Поскольку уменьшение большого клона по существу добавляет параметр, можно провести тест отношения правдоподобия.Как показано на фиг., P-значения для всех испытуемых, протестированных таким образом, были <0,05, что указывает на то, что репликация вируса без мутаций не является недостаточным объяснением данных.

Два упрощения могут сделать этот тест слишком консервативным. Во-первых, тест предполагает, что только одна последовательность могла быть расширена. Однако у нескольких субъектов наблюдались множественные наборы идентичных изолятов. Например, субъекты S02 и S09 имеют два больших набора идентичных изолятов, которые могли возникнуть в результате клональной пролиферации.Однако статистический тест не был разработан, чтобы выявить эту закономерность. Во-вторых, используя только конфигурацию аллеля, а не данные полной последовательности, тест игнорирует другие потенциальные доказательства клональной пролиферации. Обратите внимание, что тест проверяет любой механизм, который может увеличить кратность последовательности. Например, если положительный отбор перед введением АРТ резко увеличивает частоту последовательности в латентном резервуаре, этот тест может дать положительный результат.Однако в условиях хронической инфекции архивные вирусные популяции очень разнообразны и в основном латентны, что делает такой драматический выборочный поиск маловероятным. Следует упомянуть еще одно важное упрощение. Слияние, используемое в этом тесте, моделирует единственную одновременную выборку развивающейся популяции, переживающей смену поколений; однако скрытый резервуар для ВИЧ-1 — это архив, пополняемый с течением времени, более похожий на продольный образец (Nickle et al., 2003). В целом, этот анализ распределения идентичных изолятов больше соответствует клональной экспансии инфицированных клеток, чем заражению множества клеток доминантной вирусной популяцией без мутаций.

Обсуждение

Чрезвычайно стабильный латентный резервуар ВИЧ-1 в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках является основным препятствием для лечения (Finzi et al., 1999; Siliciano et al., 2003; Strain et al., 2003; Crooks et al., 2015). Есть опасения, что резервуар может поддерживаться или даже увеличиваться за счет клеточной пролиферации, даже если репликация вируса полностью остановлена ​​АРТ. Пролиферация инфицированных клеток может быть вызвана антигенами, цитокинами или эффектами, связанными с местом интеграции (Chomont et al., 2009; Мальдарелли и др., 2014; Wagner et al., 2014). Предыдущие исследования секвенирования предоставили доказательства пролиферации инфицированных клеток in vivo (Tobin et al., 2005; Bailey et al., 2006; Imamichi et al., 2014; Maldarelli et al., 2014; Wagner et al., 2014; Cohn et al., 2015; von Stockenstrom et al., 2015; Lorenzi et al., 2016; Simonetti et al., 2016). Однако полное понимание важности клональной экспансии требует рассмотрения трех ограничений текущих исследований. Во-первых, большая часть доказательств клональной экспансии получена из исследований, показывающих, что несколько независимых последовательностей от одного пациента идентичны.Однако у большинства пациентов, получающих АРТ,> 98% провирусов являются дефектными (Ho et al., 2013; Bruner et al., 2016; Imamichi et al., 2016), и, следовательно, без полноразмерного секвенирования (Chomont et al. ., 2009; Maldarelli et al., 2014; Wagner et al., 2014) или прямая демонстрация вирусной репликации (Lorenzi et al., 2016), следует предположить, что идентичные последовательности представляют дефектный вирус, особенно потому, что клетки, несущие дефектные провирусы с меньшей вероятностью погибнут от вирусных цитопатических эффектов или лизиса эффекторными клетками-хозяевами.Во-вторых, в большинстве исследований используются субгеномные ампликоны, и возможно, что последовательности, идентичные в анализируемых областях, отличаются в других частях генома (Laskey et al., 2016). Что наиболее важно, даже полная идентичность вирусной последовательности не доказывает клональную экспансию; альтернативное объяснение — заражение множества клеток доминирующим видом вируса. Анализ сайта интеграции предоставляет прямые доказательства клональной экспансии, но не устанавливает репликационную способность.

В свете этих вопросов особое значение имеют два недавних исследования.Simonetti et al. описали увеличенный клеточный клон, несущий компетентный к репликации провирус, интегрированный в уникальный сайт в геноме человека, который не может быть точно картирован (Simonetti et al., 2016). Этот клон был идентифицирован у пациента с сопутствующим злокачественным новообразованием, которое могло способствовать клональной экспансии (Simonetti et al., 2016). Lorenzi et al. недавно продемонстрировали, что 54% ​​репликационно-компетентных изолятов от четырех пролеченных пациентов имеют последовательности env , идентичные другим изолятам от того же человека (Lorenzi et al., 2016). Вместе эти исследования подчеркивают тревожную возможность того, что пролиферация инфицированных клеток in vivo может быть основным фактором в определении состава и стабильности латентного резервуара.

Представленные здесь данные по-разному способствуют нашему пониманию этой проблемы. Мы непосредственно демонстрируем, что клетки, несущие репликационно-компетентный ВИЧ-1, могут пролиферировать ex vivo без образования инфекционного вируса, а затем высвобождать вирус при последующей стимуляции. Таким образом, сильные митогенные стимулы не всегда реактивируют латентный ВИЧ-1.В свете короткого периода полужизни продуктивно инфицированных клеток (Ho et al., 1995; Wei et al., 1995) это открытие помогает объяснить, как клональная экспансия может происходить in vivo. Мы также демонстрируем наличие большого количества латентно инфицированных клеток, несущих идентичные вирусные последовательности, так что клетки с идентичными последовательностями можно обычным образом улавливать в одном образце крови от большинства пациентов. В целом 57% изолятов имели последовательностей env , идентичных другим изолятам от того же пациента.Этот вывод очень хорошо согласуется с исследованием Lorenzi et al. (2016). Далее мы показали, что последовательности, идентичные в гене env , идентичны по всему геному. Кроме того, с помощью двух независимых подходов мы искали доказательства того, что идентичные последовательности возникли в результате заражения нескольких клеток доминирующим вирусным видом. Оба подхода не смогли подтвердить эту альтернативную гипотезу, что привело нас к объяснению, что идентичные последовательности возникли в результате пролиферации in vivo латентно инфицированных клеток.Окончательное доказательство потребует одновременной идентификации сайта интеграции и демонстрации способности к репликации для многих провирусов от нескольких пациентов, чего нельзя легко достичь с помощью современных технологий. Тем не менее, представленные здесь эксперименты повышают вероятность того, что значительная часть латентного резервуара создается за счет пролиферации клеток, что, как показывают наши эксперименты ex vivo, может происходить без высвобождения инфекционного вируса.

Наши результаты имеют значение для измерения скрытого резервуара.Хотя методы определения провирусной ДНК на основе ПЦР широко используются, существует большое расхождение между анализами латентного резервуара на основе культивирования и ПЦР. В сравнительных экспериментах ПЦР-анализы на провирусную ДНК дают частоты инфицированных клеток, которые примерно в 300 раз превышают частоты, измеренные QVOA (Eriksson et al., 2013). В основном это связано с тем, что подавляющее большинство провирусов являются дефектными (Ho et al., 2013; Bruner et al., 2016; Imamichi et al., 2016). Однако количество провирусов, которые кажутся неповрежденными при полноразмерном секвенировании, по-прежнему превышает количество, индуцированное высвобождением инфекционного вируса в стандартном QVOA, в 20–60 раз (Ho et al., 2013; Bruner et al., 2016). Здесь мы показываем, используя версию QVOA с множественной стимуляцией, что дополнительные изоляты репликационно-компетентного ВИЧ-1 могут быть получены после второго, третьего и четвертого дополнительных раундов активации Т-клеток. В среднем только 60% изолятов, полученных в итоге с помощью MS-VOA, выросли после однократной стимуляции. Таким образом, стандартный QVOA и другие анализы, которые полагаются на один раунд активации Т-клеток для индукции латентного ВИЧ-1, могут недооценивать частоту латентно инфицированных клеток, как предполагалось ранее (Ho et al., 2013). Важно определить, чем объясняется это различие. Некоторые провирусы, которые кажутся неповрежденными при полноразмерном секвенировании, могут содержать незначительные миссенс-мутации, снижающие способность к репликации. Однако, когда очевидно интактные провирусы были реконструированы и протестированы на репликацию в первичных CD4 ⁺ Т-лимфобластах, шесть из шести провирусов от четырех разных инфицированных индивидуумов показали репликацию, эквивалентную репликации NL4-3 и репликационно-компетентных вирусов, выделенных от тех же людей ( Ho et al., 2013). Другая возможность заключается в том, что некоторые провирусы постоянно подавляются за счет интеграции в области, не допускающие экспрессию вирусных генов (Jordan et al., 2003; Lewinski et al., 2005), посредством транскрипционной интерференции (Han et al., 2008; Lenasi et al., 2008; Shan et al., 2011), либо эпигенетическими модификациями (Pearson et al., 2008; Blazkova et al., 2009; Tyagi et al., 2010). Наконец, стохастические особенности механизма трансактивации Tat могут предотвратить индукцию всех интактных провирусов даже в условиях активации Т-клеток (Razooky et al., 2015). Для выявления успешных стратегий обращения с задержкой может потребоваться более глубокое понимание этих проблем.

Возможность того, что значительная часть латентного резервуара возникает из-за пролиферации меньшего числа инфицированных клеток, представляет некоторые очевидные проблемы для усилий по лечению ВИЧ-1. Будет важно определить факторы, способствующие распространению. Кроме того, поскольку общий размер резервуара не увеличивается со временем (Finzi et al., 1999; Siliciano et al., 2003; Crooks et al., 2015), любая пролиферация должна быть примерно уравновешена потерей клеток, и будет важно понять задействованные механизмы и можно ли их усилить, чтобы способствовать излечению.

Материалы и методы

Субъекты исследования

Субъектами были ВИЧ-1-инфицированные взрослые, которые соответствовали критериям включения подавления виремии до <20 копий РНК ВИЧ-1 / мл плазмы на АРТ в течение> 6 месяцев. Это исследование было одобрено Наблюдательным советом Джонса Хопкинса.Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов.

MS-VOA

MS-VOA выполняли на очищенных покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках, как описано ранее (Ho et al., 2013; Laird et al., 2013, 2016) с модификациями, позволяющими четыре последовательных стимуляции с PHA (). Покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки были выделены из PBMC с использованием двухэтапного протокола отрицательной селекции (Laird et al., 2016) с моноклональными антителами и магнитными шариками (Miltenyi Biotec), как описано ранее, и помещены в верхние камеры 12-луночного планшета. планшеты Transwell (Corning) с заранее определенным предельным разведением для вирусного разрастания (200 000 клеток на лунку).Клетки активировали 0,5 мкг / мл ФГА и облучали аллогенные PBMC от нормальных доноров, как описано ранее (Finzi et al., 1997, 1999; Siliciano et al., 2003). На следующий день половину среды из каждой трансвеллеры удаляли и заменяли свежей средой без PHA, а затем 10 ⁶ клеток MOLT-4 / CCR5 добавляли в нижнюю камеру трансвелл, чтобы обеспечить надежную репликацию вируса, высвобожденного из лунки. инфицированные клетки. Предыдущее исследование показало, что рост вирусов в этой системе трансвелл эквивалентен таковому при прямом совместном культивировании (Ho et al., 2013). Клетки MOLT-4 / CCR5 были получены из программы реагентов на СПИД Национального института здравоохранения и поддерживались в G418 до использования в анализе. Клетки были протестированы на экспрессию CCR5 с помощью проточной цитометрии и оказались отрицательными на микоплазму. Через 8 дней после начальной стимуляции PHA половину объема как из верхней, так и из нижней камер каждой трансвеллеров переносили на новый набор планшетов трансвелл для второго раунда стимуляции PHA. Исходные чашки культивировали без дополнительной стимуляции в течение всего 21 дня.Рестимулированные чашки культивировали в течение 8 дней после второго раунда стимуляции PHA, а затем разделяли, как указано выше, для создания третьего набора чашек, которые получали третий раунд стимуляции. Точно так же эти пластины были разделены 8 дней спустя, чтобы получить четвертый набор пластин, который получил четвертый раунд стимуляции. ELISA p24 (PerkinElmer) выполняли на супернатанте через 21 день после каждого соответствующего раунда стимуляции PHA ().

Разведение CFSE и окрашивание маркером активации / истощения

Аликвоту покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток окрашивали 5 мкМ CFSE перед начальной стимуляцией PHA.Разведение CFSE анализировали через 1 неделю с помощью проточной цитометрии с использованием 488-нм лазера на цитометре FACSCanto II (BD) с эмиссией 492/517 нм. Нестимулированные клетки служили контролем. Экспрессию маркеров активации анализировали через 1 неделю после каждого раунда стимуляции PHA. Аликвоту клеток окрашивали анти-CD4 (FITC), анти-CD25 (APC), анти-CD69 (APC) и анти-HLA-DR (APC) антителами (BioLegend) при 4 ° C в течение 15–30 мин. и анализировали проточной цитометрией на цитометре FACSCanto II. Клетки, которые не получили последнего раунда стимуляции PHA, служили контролем.Для оценки изменений в экспрессии ингибирующих рецепторов клетки окрашивали через 1 неделю после каждого раунда активации PHA антителами против PD1 (FITC), против CTLA-4 (PE) и против Tim-3 (P3 / Cy7) ( BioLegend) и проанализированы методом проточной цитометрии.

Выделение

РНК, синтез кДНК и амплификация гена env

Вирусную РНК выделяли из 200 мкл супернатанта из каждой лунки p24 ⁺ с использованием набора для вирусной РНК ZR-96 (Zymo Research Corporation). Затем РНК обрабатывали ДНКазой (Thermo Fisher Scientific) и подвергали обратной транскрипции с использованием набора qScript cDNA Supermix (Quanta Biosciences).Поскольку культуры были засеяны при предельном разведении для роста вируса, мы провели вложенную ПЦР на неразбавленной кДНК из каждой лунки. Вложенную ПЦР для области V3-V4 env проводили с использованием 600 нг кДНК и праймеров ES7 (5′-CTGTTAAATGGCAGTCTAGC-3 ‘) и ES8 (5′-CACTTCTCCAATTGTCCCTCA-3′) для внешней реакции. Внешние продукты ПЦР разбавляли 1:50, и 5 мкл этого разведения использовали для внутренней реакции ПЦР с праймерами Nesty8 (5’-CATACATTGCTTTTCCTACT-3 ‘) и DLoop (5′-GTCTAGCAGAAGAAGAGG-3’).Праймеры были получены от Integrated DNA Technologies. Условия амплификации были следующими: денатурация при 94 ° C в течение 3 мин, затем 40 циклов денатурации при 94 ° C в течение 30 с; отжиг при 55 ° С в течение 30 с; и удлинение при 68 ° C в течение 5 мин. Продукты ПЦР обрабатывали в 1% агарозном геле, и полосы экстрагировали с использованием набора для экстракции геля QIAquick (QIAGEN). Экстрагированная ДНК была проанализирована непосредственно секвенированием по Сэнгеру в Genewiz, Inc.

Амплификация гена env из провирусной ДНК

Вложенная ПЦР, проведенная при предельном разведении, была использована для анализа гена провирусов env в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках от изучаемых предметов.Амплификацию выполняли, как описано ранее (Bailey et al., 2006), за исключением того, что внешними праймерами для ПЦР были ES7 / ES8, описанные в предыдущем абзаце. 1 мкл внешнего продукта ПЦР использовали для внутренней реакции ПЦР с праймерами Nesty8 / DLoop, описанными в предыдущем абзаце. Продукты ПЦР были напрямую секвенированы секвенированием по Сэнгеру.

Полногеномное секвенирование

Для репрезентативных изолятов вирусную РНК секвенировали путем амплификации одного генома, как описано ранее (Hatziioannou et al., 2014). Вирусную РНК в супернатантах лунок p24 ⁺ экстрагировали и подвергали обратной транскрипции. кДНК была серийно разведена и амплифицирована с помощью вложенных ПЦР в двух перекрывающихся полугеномных реакциях, как описано ранее (Li et al., 2010). Для каждого изолята непосредственно секвенировали 6–12 ампликонов, полученных в предельном разведении, и генерировали консенсусную последовательность полного генома, как описано в Изолятах, с идентичными последовательностями env. идентичны во всем разделе результатов генома ВИЧ-1.

Филогенетический анализ

Прямые и обратные последовательности для каждого образца были выровнены в один консенсусный контиг для каждого образца с использованием параметров сборки по умолчанию в программном обеспечении CodonCode Aligner (CodonCode Corporation). Редкие последовательности, которые не казались клональными, отбрасывали. Консенсусную последовательность каждого образца выровняли с эталонными последовательностями каталогизированных вирусов из базы данных последовательностей ВИЧ Национальной лаборатории Лос-Аламоса с использованием параметров сборки по умолчанию, которые были скорректированы с учетом всех эталонных последовательностей и последовательностей.Для создания филогенетического дерева последовательности были обрезаны до одинаковой длины. Были рассчитаны генетические расстояния, и деревья соединения соседей (Tamura et al., 2004) были сгенерированы с использованием алгоритма максимального сложного правдоподобия и параметров по умолчанию с использованием программного обеспечения MEGA7 (программа анализа молекулярной эволюционной генетики; Kumar et al., 2016). Были также созданы деревья максимального правдоподобия. Выводы не зависели от метода генерации деревьев, и деревья соединения соседей показаны на рисунках.

Статистический тест на клональную пролиферацию

Мы разработали статистический анализ, основанный на теории слияния, чтобы исследовать возможность того, что наблюдаемая высокая степень идентичности последовательностей может быть объяснена просто раундами вирусной репликации, в которых не произошло никаких мутаций. Тест применялся к подгруппе участников исследования (01, 03, 10, 11 и 12), для которых один большой набор идентичных изолятов филогенетически отличался от меньших наборов и уникальных индивидуальных последовательностей (одиночных последовательностей) от одного и того же участника () .был выбран, чтобы максимизировать вероятность наблюдения за конфигурацией в соответствии с формулой выборки Ювенса для слитка (Ewens, 1972). Этот расчет обеспечивает вероятность вложенной модели для статистического теста (т.е. вероятность без клональной пролиферации). Предполагается, что клональная пролиферация изменяет конфигурацию набора изолятов за счет взятия одной последовательности и увеличения ее множественности с помощью механизма, отсутствующего в стандартной модели слияния. Чтобы смоделировать такое поведение, мы предполагаем, что пролиферирующая последовательность является (одной из) наиболее часто наблюдаемой последовательностью и что она эффективно заменяет несколько одноэлементных последовательностей, которые в противном случае наблюдались бы в образце.и логарифмическая вероятность вычисляются для этой измененной конфигурации. Значение p получается с помощью теста отношения правдоподобия с одной степенью свободы.

Дополнительные материалы онлайн

На рис. S1 показано филогенетическое дерево последовательностей env V3-V4 из независимых изолятов репликационно-компетентного ВИЧ-1 из покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток от 12 пациентов, получающих АРТ. В таблице S1 перечислены характеристики изучаемых предметов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы (PDF)

Выражение признательности

Эта работа была поддержана коллабораториями Martin Delaney DARE, I4C и BEAT-HIV (гранты Национальных институтов здравоохранения UM1AI126611, UM1AI126603 и UM1AI126620), Консорциумом сотрудничества Американского фонда исследований СПИДа (amfAR) по ВИЧ. Грант на исследования (108165-50-RGRL) Центра исследований СПИДа Джонса Хопкинса (P30AI094189), Национальных институтов здравоохранения (грант 43222) и Медицинского института Говарда Хьюза, Фонда Билла и Мелинды Гейтс (грант OPP1115715). ), а также частично за счет федеральных средств Национального института рака и Национальных институтов здравоохранения (контракт HHSN261200800001E).D.I.S.R. благодарит за поддержку стипендию amfAR (109511-61-RKRL).

Содержание данной публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Сноски

Используемые сокращения:

ART

Антиретровирусная терапия

MS-VOA

множественная стимуляция VOA

QVOA

количественный анализ VOA

9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 9134 .Э., Феррис А.Л., Шао В., Элворд В.Г. и Хьюз С.Х. 2010 г. Природа, положение и частота мутаций, произошедших в одном цикле репликации ВИЧ-1. J. Virol. 84: 9864–9878. 10.1128 / JVI.00915-10 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Андерсон А.К., Джоллер Н. и Кучру В.К .. 2016 г. Иммунитет. 44: 989–1004. 10.1016 / j.immuni.2016.05.001 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Арчин Н.М., Либерти А.Л., Кашуба А.Д., Чоудхари С.К., Курук Дж.Д., Крукс А.М., Паркер Д.С., Андерсон Е.М., Кирни М.Ф., Штамм М.С. и др. . 2012 г. Введение вориностата нарушает латентный период ВИЧ-1 у пациентов, получающих антиретровирусную терапию. Природа. 487: 482–485. 10.1038 / nature11286 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Bailey JR, Sedaghat AR, Kieffer T., Brennan T., Lee PK, Wind-Rotolo M., Haggerty CM, Kamireddi AR, Liu Y., Lee J. и др. . 2006 г. В остаточной виремии вируса иммунодефицита человека типа 1 у некоторых пациентов, получающих антиретровирусную терапию, преобладает небольшое количество инвариантных клонов, редко обнаруживаемых в циркулирующих Т-клетках CD4 ⁺ .J. Virol. 80: 6441–6457. 10.1128 / JVI.00591-06 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Banga R., Procopio FA, Noto A., Pollakis G., Cavassini M., Ohmiti K., Corpataux JM, де Леваль Л., Панталео Г. и Перро М. 2016 г. PD-1 ⁺ и фолликулярные хелперные Т-клетки несут ответственность за стойкую транскрипцию ВИЧ-1 у леченных авиремией. Nat. Med. 22: 754–761. 10,1038 / нм.4113 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Блазкова Ю., Трейбалова К., Gondois-Rey F., Halfon P., Philibert P., Guiguen A., Verdin E., Olive D., Van Lint C., Hejnar J. и Hirsch I. 2009 г. CpG-метилирование контролирует реактивацию ВИЧ с латентного периода. PLoS Pathog. 5: e1000554 10.1371 / journal.ppat.1000554 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Boritz EA, Darko S., Swaszek L., Wolf G., Wells D., Wu X., Henry AR, Лабун Ф., Ху Дж., Амброзак Д. и др. . 2016 г. Множественные причины персистенции вируса при естественном контроле ВИЧ-инфекции.Клетка. 166: 1004–1015. 10.1016 / j.cell.2016.06.039 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Bosque A., Famiglietti M., Weyrich A.S., Goulston C., and Planelles V .. 2011 г. Гомеостатическая пролиферация не может эффективно реактивировать латентно инфицированные ВИЧ-1 CD4 + Т-клетки центральной памяти. PLoS Pathog. 7: e1002288 10.1371 / journal.ppat.1002288 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Brodin J., Zanini F., Thebo L., Lanz C., Bratt G., Neher RA, and Albert J .. 2016 г. Установление и стабильность латентного резервуара ДНК ВИЧ-1. eLife. 5: e18889 10.7554 / eLife.18889 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Bruner KM, Murray AJ, Pollack RA, Soliman MG, Laskey SB, Capoferri AA, Lai J., Strain MC, Lada SM, Хох Р. и др. . 2016 г. Дефектные провирусы быстро накапливаются во время острой инфекции ВИЧ-1. Nat. Med. 22: 1043–1049. 10.1038 / nm.4156 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Buzon M.Дж., Сун Х., Ли К., Шоу А., Сейсс К., Оуян З., Мартин-Гайо Э., Ленг Дж., Генрих Т. Дж., Ли Дж. З. и др. . 2014 г. Персистенция ВИЧ-1 в CD4 ⁺ Т-клетках со свойствами стволовых клеток. Nat. Med. 20: 139–142. 10.1038 / nm.3445 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Chomont N., El-Far M., Ancuta P., Trautmann L., Procopio FA, Yassine-Diab B., Boucher G., Boulassel MR, Ghattas G., Brenchley JM и др. . 2009 г. Размер и устойчивость резервуара ВИЧ обусловлены выживаемостью Т-клеток и гомеостатической пролиферацией.Nat. Med. 15: 893–900. 10.1038 / нм.1972 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Chun T.W., Finzi D., Margolick J., Chadwick K., Schwartz D., and Siliciano R.F .. 1995 г. Судьба ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток in vivo: количественный анализ перехода к стабильной латентности. Nat. Med. 1: 1284–1290. 10,1038 / нм1295-1284 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Chun TW, Carruth L., Finzi D., Shen X., DiGiuseppe JA, Taylor H., Hermankova M., Chadwick K., Margolick J. , Куинн Т.C., et al. . 1997a Количественная оценка латентных тканевых резервуаров и общей вирусной нагрузки организма при ВИЧ-1-инфекции. Природа. 387: 183–188. 10.1038 / 387183a0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Chun T.W., Stuyver L., Mizell S.B., Ehler L.A., Mican J.A., Baseler M., Lloyd A.L., Nowak M.A. и Fauci A.S .. 1997b Наличие индуцибельного латентного резервуара ВИЧ-1 во время высокоактивной антиретровирусной терапии. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 94: 13193–13197. 10.1073 / pnas.94.24.13193 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Cohn L.Б., Сильва И. . 2015 г. Пейзаж интеграции ВИЧ-1 при скрытой и активной инфекции. Клетка. 160: 420–432. 10.1016 / j.cell.2015.01.020 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Crooks AM, Bateson R., Cope AB, Dahl NP, Griggs MK, Kuruc JD, Gay CL, Eron JJ , Марголис Д.М., Bosch RJ и Арчин Н.М. 2015 г. Точное количественное определение латентного резервуара ВИЧ-1: значение для стратегий искоренения.J. Infect. Дис. 212: 1361–1365. 10.1093 / infdis / jiv218 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Deeks SG, Lewin SR, Ross AL, Ananworanich J., Benkirane M., Cannon P., Chomont N., Douek D. , Лифсон Дж. Д., Ло Ю. Р. и др. Рабочая группа Международного общества СПИДа к излечению. 2016 г. Глобальная научная стратегия Международного общества по СПИДу: к излечению от ВИЧ, 2016 г. Нац. Med. 22: 839–850. 10.1038 / nm.4108 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

DeHart J.Л., Циммерман Э.С., Ардон О., Монтейро-Филхо К.М., Арганьярас Э.Р., Планеллес В. 2007 г. Vpr ВИЧ-1 активирует контрольную точку G2 посредством манипулирования протеасомной системой убиквитина. Virol. Дж. 4:57 10.1186 / 1743-422X-4-57 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Eriksson S., Graf EH, Dahl V., Strain MC, Yukl SA, Lysenko ES, Bosch RJ, Lai J., Chioma S., Emad F., et al. . 2013. Сравнительный анализ показателей вирусных резервуаров в исследованиях эрадикации ВИЧ-1.PLoS Pathog. 9: e1003174 10.1371 / journal.ppat.1003174 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Ewens W.J. 1972 г. Теория выборки избирательно нейтральных аллелей. Теор. Popul. Биол. 3: 87–112. 10.1016 / 0040-5809 (72)-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Finzi D., Hermankova M., Pierson T., Carruth LM, Buck C., Chaisson RE, Quinn TC, Chadwick K ., Марголик Дж., Брукмейер Р. и др. . 1997 г. Выявление резервуара ВИЧ-1 у пациентов, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию.Наука. 278: 1295–1300. 10.1126 / science.278.5341.1295 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Finzi D., Blankson J., Siliciano JD, Margolick JB, Chadwick K., Pierson T., Smith K., Lisziewicz J., Lori Ф., Флекснер С. и др. . 1999 г. Скрытая инфекция CD4 ⁺ Т-клеток обеспечивает механизм сохранения ВИЧ-1 на протяжении всей жизни даже у пациентов, получающих эффективную комбинированную терапию. Nat. Med. 5: 512–517. 10.1038 / 8394 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Halper-Stromberg A., Лу К.Л., Кляйн Ф., Хорвиц Дж.А., Бурназос С., Ногейра Л., Эйзенрайх Т.Р., Лю К., Газумян А., Шефер У. и др. . 2014 г. Широко нейтрализующие антитела и вирусные индукторы уменьшают отскок от латентных резервуаров ВИЧ-1 у гуманизированных мышей. Клетка. 158: 989–999. 10.1016 / j.cell.2014.07.043 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Han Y., Lassen K., Monie D., Sedaghat AR, Shimoji S., Liu X., Pierson TC, Марголик Дж. Б., Силичиано Р. Ф. и Силичиано Дж. Д.. 2004 г. Покоящиеся CD4 ⁺ Т-клетки от людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), несут интегрированные геномы ВИЧ-1 внутри активно транскрибируемых генов хозяина.J. Virol. 78: 6122–6133. 10.1128 / JVI.78.12.6122-6133.2004 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Хан Й., Линь Ю.Б., Ан В., Сюй Дж., Ян Х.С., О’Коннелл К., Дордай Д., Боке Дж. Д., Силичиано Дж. Д. и Силичиано Р. Ф. 2008 г. Ориентационно-зависимая регуляция интегрированной экспрессии ВИЧ-1 путем считывания транскрипции гена хозяина. Клеточный микроб-хозяин. 4: 134–146. 10.1016 / j.chom.2008.06.008 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Hatziioannou T., Del Prete G.Q., Кил Б.Ф., Эстес Дж. Д., МакНатт М. В., Битцегейо Дж., Раймонд А., Родригес А., Шмидт Ф., Мак Трубей К. и др. . 2014 г. ВИЧ-1-индуцированный СПИД у обезьян. Наука. 344: 1401–1405. 10.1126 / science.1250761 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Хо Д.Д., Нойман А.У., Перельсон А.С., Чен В., Леонард Дж. М. и Марковиц М. 1995 г. Быстрый оборот вирионов плазмы и лимфоцитов CD4 при ВИЧ-1-инфекции. Природа. 373: 123–126. 10.1038 / 373123a0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Хо Ю.К., Шан Л., Хосман Н. Н., Ван Дж., Ласки С. Б., Розенблум Д. И., Лай Дж., Бланксон Дж. Н., Силичиано Дж. Д. и Силичиано Р. Ф. 2013. Компетентные к репликации неиндуцированные провирусы в латентном резервуаре повышают барьер на пути лечения ВИЧ-1. Клетка. 155: 540–551. 10.1016 / j.cell.2013.09.020 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Hrecka K., Gierszewska M., Srivastava S., Kozaczkiewicz L., Swanson SK, Florens L., Washburn М.П., ​​Сковронски Дж. 2007 г. Лентивирусный Vpr узурпирует Cul4-DDB1 [VprBP] E3 убиквитинлигазу для модуляции клеточного цикла.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 104: 11778–11783. 10.1073 / pnas.0702102104 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Имамичи Х., Натараджан В., Адельсбергер Дж. У., Рем Калифорния, Лемпицки Р. А., Дас Б., Хазен А., Имамичи Т. , и переулок HC. 2014 г. Продолжительность жизни CD4 + Т-клеток эффекторной памяти определяется некомпетентным к репликации интегрированным провирусом ВИЧ-1. СПИД. 28: 1091–1099. 10.1097 / QAD.0000000000000223 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Имамичи Х., Дьюар Р.Л., Адельсбергер Дж.У., Рем К.А., О’Догерти У., Паксинос Э.Е., Фаучи А.С. и Лейн Х.С. 2016 г. Дефектные провирусы ВИЧ-1 продуцируют новые виды белок-кодирующих РНК у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих комбинированную антиретровирусную терапию. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 113: 8783–8788. 10.1073 / pnas.160^{13 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]}

Джордан А., Бисгроув Д. и Вердин Э .. 2003 г. ВИЧ воспроизводимо вызывает скрытую инфекцию после острой инфекции Т-клеток in vitro. EMBO J. 22: 1868–1877.10.1093 / emboj / cdg188 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Jowett J.B., Planelles V., Poon B., Shah N.P., Chen M.L. и Chen I.S .. 1995 г. Ген вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr задерживает инфицированные Т-клетки в фазе G ₂ + M клеточного цикла. J. Virol. 69: 6304–6313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Кумар С., Стечер Г. и Тамура К. 2016 г. MEGA7: молекулярно-эволюционный генетический анализ версии 7.0 для больших наборов данных.Мол. Биол. Evol. 33: 1870–1874. 10.1093 / molbev / msw054 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Лэрд Г.М., Эйзель Э.Э., Раби С.А., Лай Дж., Чиома С., Бланксон Дж. Н., Силичиано Дж. Д. и Силичиано Р. Ф. 2013. Быстрая количественная оценка латентного резервуара ВИЧ-1 с помощью анализа вирусного роста. PLoS Pathog. 9: e1003398 10.1371 / journal.ppat.1003398 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Лэрд Г.М., Розенблум Д.И., Лай Дж., Силичиано Р.Ф. и Силичиано Дж.D .. 2016 г. Измерение частоты латентного ВИЧ-1 в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках с использованием анализа сокультивирования с ограниченным разведением. Методы Мол. Биол. 1354: 239–253. 10.1007 / 978-1-4939-3046-3_16 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Ласки С.Б., Полмейер К.В., Брунер К.М. и Силичиано Р.Ф. 2016 г. Оценка клональной экспансии ВИЧ-инфицированных клеток: Оптимизация стратегий ПЦР для прогнозирования клональности. PLoS Pathog. 12: e1005689 10.1371 / journal.ppat.1005689 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Lenasi T., Контрерас X., Петерлин Б.М. 2008 г. Транскрипционная интерференция противодействует экспрессии провирусных генов, способствуя латентному периоду ВИЧ. Клеточный микроб-хозяин. 4: 123–133. 10.1016 / j.chom.2008.05.016 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Левински М.К., Бисгроув Д., Шинн П., Чен Х., Хоффманн К., Ханненхалли С., Вердин Э., Берри С.К., Эккер Дж. Р. и Бушман Ф. Д.. 2005 г. Полногеномный анализ хромосомных особенностей, подавляющих транскрипцию вируса иммунодефицита человека. J. Virol.79: 6610–6619. 10.1128 / JVI.79.11.6610-6619.2005 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Li H., Bar KJ, Wang S., Decker JM, Chen Y., Sun C., Salazar- Гонсалес Дж. Ф., Салазар М. Г., Learn GH, Morgan CJ и др. . 2010 г. Высокая множественность инфицирования ВИЧ-1 у мужчин, практикующих секс с мужчинами. PLoS Pathog. 6: e1000890 10.1371 / journal.ppat.1000890 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Lorenzi J.C., Cohen Y.Z., Cohn L.B., Kreider E.F., Barton J.П., Джидж Г.Х., Оливейра Т., Лавин К.Л., Хорвиц Дж.А., Сеттлер А. и др. . 2016 г. Парная количественная и качественная оценка репликационно-компетентного резервуара ВИЧ-1 и сравнение с интегрированной провирусной ДНК. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 113: E7908 – E7916. 10.1073 / pnas.1617789113 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Мальдарелли Ф., Кирни М., Палмер С., Стивенс Р., Микан Дж., Полис М. А., Дэви Р. Т., Ковач Дж. ., Шао В., Рок-Кресс Д. и др. . 2013. Популяции ВИЧ велики и нелинейным образом накапливают большое генетическое разнообразие.J. Virol. 87: 10313–10323. 10.1128 / JVI.01225-12 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Мальдарелли Ф., Ву Х., Су Л., Симонетти Ф. Р., Шао В., Хилл С., Шпиндлер Дж. , Феррис А.Л., Меллорс Дж. В., Кирни М. Ф. и др. . 2014 г. Конкретные сайты интеграции ВИЧ связаны с клональной экспансией и персистенцией инфицированных клеток. Наука. 345: 179–183. 10.1126 / science.1254194 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Мански Л.М., Темин Х.М. 1995 г. Более низкая частота мутаций вируса иммунодефицита человека типа 1 in vivo, чем предсказано на основе точности очищенной обратной транскриптазы.J. Virol. 69: 5087–5094. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Никл Д.К., Дженсен М.А., Шрайнер Д., Броди С.Дж., Френкель Л.М., Миттлер Дж. 2003 г. Эволюционные индикаторы резервуаров и компартментов вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 77: 5540–5546. 10.1128 / JVI.77.9.5540-5546.2003 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Pearson R., Kim YK, Hokello J., Lassen K., Friedman J., Tyagi M., and Карн Дж .. 2008 г. Эпигенетическое подавление транскрипции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) за счет образования рестриктивных структур хроматина на длинных концевых повторах вируса приводит к постепенному переходу ВИЧ в латентный период.J. Virol. 82: 12291–12303. 10.1128 / JVI.01383-08 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Разуки Б.С., Пай А., Олл К., Рузин И.М. и Вайнбергер Л.С. 2015 г. Запрограммированная программа задержки ВИЧ. Клетка. 160: 990–1001. 10.1016 / j.cell.2015.02.009 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Richman D.D., Margolis D.M., Delaney M., Greene W.C., Hazuda D., and Pomerantz R.J. 2009 г. Проблема поиска лекарства от ВИЧ-инфекции. Наука. 323: 1304–1307.10.1126 / science.1165706 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Romani B., and Cohen E.A .. 2012 г. Вспомогательные белки лентивирусов Vpr и Vpx захватывают убиквитинлигазу cullin4-DDB1 (DCAF1) E3. Curr. Opin. Virol. 2: 755–763. 10.1016 / j.coviro.2012.09.010 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Розенблум Д.И., Эллиотт О., Хилл А.Л., Хенрих Т.Дж., Силичиано Дж.М. и Силичиано Р.Ф. 2015 г. Разработка и интерпретация анализов предельного разведения: общие принципы и приложения к латентному резервуару для вируса иммунодефицита человека-1.Открытый форум Infect. Дис. 2: ofv123 10.1093 / ofid / ofv123 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Сакаи К., Димас Дж. И Ленардо М.Дж .. 2006 г. Дополнительные белки Vif и Vpr независимо вызывают ВИЧ-1-индуцированную цитопатичность Т-клеток и остановку клеточного цикла. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 103: 3369–3374. 10.1073 / pnas.0509417103 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Шредер А.Р., Шинн П., Чен Х., Берри К., Эккер Дж. Р. и Бушман Ф. 2002 г. Интеграция ВИЧ-1 в геном человека способствует активным генам и локальным «горячим точкам».Клетка. 110: 521–529. 10.1016 / S0092-8674 (02) 00864-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Schröfelbauer B., Hakata Y., and Landau N.R .. 2007 г. Функция Vpr ВИЧ-1 опосредуется взаимодействием со специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком DDB1. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 104: 4130–4135. 10.1073 / pnas.0610167104 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Scripture-Adams D.D., Brooks D.G., Korin Y.D., and Zack J.A .. 2002 г. Интерлейкин-7 индуцирует экспрессию латентного вируса иммунодефицита человека 1 типа с минимальным влиянием на фенотип Т-клеток.J. Virol. 76: 13077–13082. 10.1128 / JVI.76.24.13077-13082.2002 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Shan L., Yang HC, Rabi SA, Bravo HC, Shroff NS, Irizarry RA, Zhang H., Margolick JB, Siliciano JD и Siliciano RF. 2011 г. Влияние уровня транскрипции и ориентации гена-хозяина на латентность ВИЧ-1 в модели первичных клеток. J. Virol. 85: 5384–5393. 10.1128 / JVI.02536-10 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Shankarappa R., Марголик Дж. Б., Ганге С. Дж., Родриго А. Г., Апчерч Д., Фарзадеган Х., Гупта П., Ринальдо К. Р., Learn G.H., He X. и др. . 1999 г. Последовательные эволюционные изменения вируса, связанные с прогрессированием инфекции вируса иммунодефицита человека 1 типа. J. Virol. 73: 10489–10502. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Силичиано Дж. Д. и Силичиано Р. Ф. 2005 г. Расширенный анализ культуры для обнаружения и количественного определения латентно инфицированных, покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток, несущих репликационно-компетентный вирус, у ВИЧ-1-инфицированных лиц.Методы Мол. Биол. 304: 3–15. [PubMed] [Google Scholar]

Siliciano J.D., Kajdas J., Finzi D., Quinn T.C., Chadwick K., Margolick J.B., Kovacs C., Gange S.J. и Siliciano R.F .. 2003 г. Долгосрочные последующие исследования подтверждают стабильность латентного резервуара ВИЧ-1 в покоящихся CD4 ⁺ Т-клетках. Nat. Med. 9: 727–728. 10,1038 / нм880 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Симонетти Ф. Р., Соболевски М. Д., Файн Э., Шао В., Шпиндлер Дж., Хаттори Дж., Андерсон Э. М., Уоттерс С.А., Хилл С., Ву Х. и др. . 2016 г. Клонально размноженные CD4 ⁺ Т-клетки могут продуцировать инфекционный ВИЧ-1 in vivo. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 113: 1883–1888. 10.1073 / pnas.1522675113 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Сориано-Сарабия Н., Бейтсон Р.Э., Даль Н.П., Крукс А.М., Курук Д.Д., Марголис Д.М. и Арчин Н.М. 2014 г. Количественное определение репликационно-компетентного ВИЧ-1 в популяциях покоящихся CD4 ⁺ Т-клеток. J. Virol. 88: 14070–14077. 10.1128 / JVI.01900-14 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Стюарт С.А., Пун Б., Джоветт Дж. Б. и Чен И.С. .. 1997 г. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз после остановки клеточного цикла. J. Virol. 71: 5579–5592. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Stewart S.A., Poon B., Song J.Y. и Chen I.S .. 2000 г. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз за счет активации каспаз. J. Virol. 74: 3105–3111. 10.1128 / JVI.74.7.3105-3111.2000 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Strain M.К., Гюнтард Х.Ф., Хавлир Д.В., Игнасио К.С., Смит Д.М., Ли-Браун А.Дж., Макаранас Т.Р., Лам Р.Й., Дейли О.А., Фишер М. и др. . 2003 г. Гетерогенная скорость клиренса долгоживущих лимфоцитов, инфицированных ВИЧ: внутренняя стабильность предсказывает сохранение на протяжении всей жизни. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 100: 4819–4824. 10.1073 / pnas.0736332100 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Тамура К., Ней М. и Кумар С. 2004 г. Перспективы вывода очень крупных филогений с помощью метода объединения соседей.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 101: 11030–11035. 10.1073 / pnas.0404206101 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Tobin NH, Learn GH, Holte SE, Wang Y., Melvin AJ, McKernan JL, Pawluk DM, Mohan KM, Lewis PF, Маллинз Дж. И., Френкель Л. М.. 2005 г. Доказательства того, что виремии низкого уровня во время эффективной высокоактивной антиретровирусной терапии являются результатом двух процессов: экспрессии архивного вируса и репликации вируса. J. Virol. 79: 9625–9634. 10.1128 / JVI.79.15.9625-9634.2005 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Тьяги М., Пирсон Р.Дж. и Карн Дж. 2010 г. Установление латентности ВИЧ в первичных клетках CD4 ⁺ происходит из-за эпигенетического подавления транскрипции и ограничения P-TEFb. J. Virol. 84: 6425–6437. 10.1128 / JVI.01519-09 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Vandergeeten C., Fromentin R., DaFonseca S., Lawani MB, Sereti I., Lederman MM, Ramgopal M., Роути Дж. П., Секали Р. П. и Чомонт Н.. 2013. Интерлейкин-7 способствует сохранению ВИЧ во время антиретровирусной терапии. Кровь. 121: 4321–4329. 10.1182 / blood-2012-11-465625 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

von Stockenstrom S., Odevall L., Lee E., Sinclair E., Bacchetti P., Killian M. , Эплинг Л., Шао В., Хох Р., Хо Т. и др. . 2015 г. Продольная генетическая характеристика показывает, что пролиферация клеток поддерживает постоянный пул ДНК ВИЧ 1 типа во время эффективной терапии ВИЧ. J. Infect. Дис. 212: 596–607.10.1093 / infdis / jiv092 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Wagner TA, McLaughlin S., Garg K., Cheung CY, Larsen BB, Styrchak S., Huang HC, Edlefsen PT, Mullins JI и Френкель LM. 2014 г. Распространение клеток с ВИЧ, интегрированных в гены рака, способствует стойкой инфекции. Наука. 345: 570–573. 10.1126 / science.1256304 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Wang F.X., Xu Y., Sullivan J., Souder E., Argyris E.G., Acheampong E.A., Fisher J., Sierra M., Thomson M.M., Najera R., et al. . 2005 г. ИЛ-7 является мощным и провирусным штаммом-специфическим индуктором латентных клеточных резервуаров ВИЧ-1 у инфицированных людей, получающих ВААРТ с подавлением вируса. J. Clin. Вкладывать деньги. 115: 128–137. 10.1172 / JCI200522574 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Wei X., Ghosh SK, Taylor ME, Johnson VA, Emini EA, Deutsch P., Lifson JD, Bonhoeffer S., Nowak MA, Hahn BH и др. . 1995 г. Вирусная динамика при инфекции вирусом иммунодефицита человека 1 типа.Природа. 373: 117–122. 10.1038 / 373117a0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Wong J.K., Hezareh M., Günthard H.F., Havlir D.V., Ignacio C.C., Spina C.A. и Richman D.D .. 1997 г. Восстановление репликационно-компетентного ВИЧ, несмотря на длительное подавление плазменной виремии. Наука. 278: 1291–1295. 10.1126 / science.278.5341.1291 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Termo decommonisso de Restauração Florestal — TCRF para cumprimento da obrigação referente à компенсация

25.10.2017 | Текущий темп: 5 минут

img class = alignnone size-full wp-image-4995 aligncenter src = https: //www.legnetbrasil.com.br/wp-content/uploads/2017/10/images2.jpg alt = supressão Vegetal width = 276 height = 183/

A Resolução concunta SEA / INEA nº 654 от 23 de outubro de 2017, устанавливая процедуру для празднования срока действия компромисса в ресторане Florestal — TCRF para cumprimento da obrigação referente àpensação de que trata o art.3º-b da Lei № 6.572 / 2013, Introductionzido pela lei № 7.061 / 2015.

De acordo com o art. 17 da Lei Federal nº 11.428 / 2006, o corte ou a supressão de Vegetação primária or secundária nos estágios médio or avançado de regéeração do Bioma Mata Atlântica, autorizados pela Lei, ficam condicionados àreçaçação des àreçaçação de ççaçáç à. A Lei Federal nº 12.651 / 2012, em seu artigo 33, § 4º, признает aos órgãos do SISNAMA соревнованием для регулирования das especificidades técnicas acerca de reposição florestal; a Resolução INEA nº 89/2014, que Dispõe sobre as proporções mínimas aplicáveis ​​para reposição florestal, decorrentes do corte ou supressão de Vegetação pertencente às formações florestais nativas e ecossistemas associados deservica de Atlantis, Deservata Deservis, Deservata Deservis, Deservata Deservis, , para fins de licenciamento ambiental e / ou de autorização para supressão de Vegetação nativa no estado do Рио-де-Жанейро.

O artigo 3º da Lei Estadual nº 6.572/2013 Trouxe, alternativamente à obrigação de fazer criada pelo artigo 36 da Lei Federal nº 9.985/2000, возможность депозита на монтанте-де-рекурс, фиксированное лицо или конкурентное право à disição de mecanismo operacional e financeiro Implementado pela Secretaria de Estado do Ambiente para viabilizar e centralizar a Execução concunta de obrigações de diversos empreendedores, Objetivando ganho de escala, de sinergia e de e de eficiência de eficiência membienteo do ambienteo do ambienteo do Lei, Introduzida pela Lei Estadual nº 7.061/2015, o artigo 3º-B passou a prever que este mecanismo operacional e financialiro aplicar-se também, e no que couber, à компенсация окружающей среды превиста нет §1º do art. 17 da Lei Federal nº 11.428 / 2006; a Resolução Conjunta SEA / INEA № 630/2016, que regulamenta o mecanismo financialiro depensação florestal de que trata o §1º do art. 17 da Lei Federal nº 11.428 / 2006, em consonância com o disposto no art. 3º-B da Lei Estadual № 6.572 / 2013; e por fim, обязательное установление процедур, установленных учреждениями, для регулярного проведения мероприятий Termos de Compromisso de Restauração Florestal entre a Secretaria de Estado do Ambiente — SEA, o Instituto Estadual do Ambiente — INEA e o empreendedor; РЕШЕНИЕ: Ст.1o — A presente resolução regula, no âmbito do Estado do Rio de Janeiro, os procedure administrativos para a Celebração de Termo de Compromisso de Restauração Florestal — TCRF para cumprimento da obrigação referente àpensação de que trata o art. 3º-b da Lei Estadual № 6.572 / 2013, Introductionzido pela Lei Estadual № 7.061 / 2015, e dá outras providências. Изобразительное искусство. 2º — Para os fins do disposto nesta Resolução, entende-se por Termo de Compromisso de Restauração Florestal — TCRF o instrumento com força de título executivo внесудебный, por meio do qual são формализадас и учреждение в качестве компенсации за создание параграфа reposição florestal prevista no §1º do art.17 da Lei Federal nº 11.428 / 2006 e na Resolução INEA nº 89/2014, em consonância com o disposto na Lei Estadual nº 6.572/2013, regulamentada pela Resolução Conjunta SEA / INEA nº 630/2016. Изобразительное искусство. 3o — Para Celebração do TCRF será instituído procedure administrativo próprio, devendo conter, no mínimo, os seguintes documentos: I — cópia do Requerimento de licença ambiental, autorização ambiental para supressão de Vegetaça de Aledão obrigação de reposição florestal no Territoryo estadual; II — cópia do Parecer Técnico da Diretoria de Licenciamento do INEA ou de suas Superintendências Regionais, com a manifestação Favor acerca do Requerimento original e o cálculo do do valor devido a título depensação florestal; III — cópia da Notificação para apresentação da modalidadepensatória de reposição florestal; IV — Carta do Requerente optando pelo depósito do recurso da компенсация florestal no mecanismo financeiro de Restauração florestal, em Complidade com o § 2º do art.

No related posts.